DNA interstrand crosslinks (ICLs) are toxic DNA lesions whose repair occurs in the S phase of metazoans via an unknown mechanism. Here, we describe a cell-free system based on Xenopus egg extracts that supports ICL repair. During DNA replication of a plasmid containing a site-specific ICL, two replication forks converge on the crosslink. Subsequent lesion bypass involves advance of a nascent leading strand to within one nucleotide of the ICL, followed by incisions, translesion DNA synthesis, and extension of the nascent strand beyond the lesion. Immunodepletion experiments suggest that extension requires DNA polymerase zeta. Ultimately, a significant portion of the input DNA is fully repaired, but not if DNA replication is blocked. Our experiments establish a mechanism for ICL repair that reveals how this process is coupled to DNA replication.

We have determined the crystal structure of an active, hexameric fragment of the gene 4 helicase from bacteriophage T7. The structure reveals how subunit contacts stabilize the hexamer. Deviation from expected six-fold symmetry of the hexamer indicates that the structure is of an intermediate on the catalytic pathway. The structural consequences of the asymmetry suggest a "binding change" mechanism to explain how cooperative binding and hydrolysis of nucleotides are coupled to conformational changes in the ring that most likely accompany duplex unwinding. The structure of a complex with a nonhydrolyzable ATP analog provides additional evidence for this hypothesis, with only four of the six possible nucleotide binding sites being occupied in this conformation of the hexamer. This model suggests a mechanism for DNA translocation.

Alignments of 105 site-specific recombinases belonging to the Int family of proteins identified extended areas of similarity and three types of structural differences. In addition to the previously recognized conservation of the tetrad R-H-R-Y, located in boxes I and II, several newly identified sequence patches include charged amino acids that are highly conserved and a specific pattern of buried residues contributing to the overall protein fold. With some notable exceptions, unconserved regions correspond to loops in the crystal structures of the catalytic domains of λ Int (Int c170) and HP1 Int (HPC) and of the recombinases XerD and Cre. Two structured regions also harbor some pronounced differences. The first comprises β-sheets 4 and 5, α-helix D and the adjacent loop connecting it to α-helix E: two Ints of phages infecting thermophilic bacteria are missing this region altogether; the crystal structures of HPC, XerD and Cre reveal a lack of β-sheets 4 and 5; Cre displays two additional β-sheets following α-helix D; five recombinases carry large insertions. The second involves the catalytic tyrosine and is seen in a comparison of the four crystal structures. The yeast recombinases can theoretically be fitted to the Int fold, but the overall differences, involving changes in spacing as well as in motif structure, are more substantial than seen in most other proteins. The phenotypes of mutations compiled from several proteins are correlated with the available structural information and structure-function relationships are discussed. In addition, a few prokaryotic and eukaryotic enzymes with partial homology with the Int family of recombinases may be distantly related, either through divergent or convergent evolution. These include a restriction enzyme and a subgroup of eukaryotic RNA helicases (D-E-A-D proteins).

A large group of transcription factors regulating cell growth and differentiation share a dimeric alpha-helical DNA-binding domain termed the basic region helix-loop-helix (bHLH). bHLH proteins associate as homodimers and heterodimers having distinctive DNA-binding activities and transcriptional activities that are central to the regulated differentiation of a number of tissues. Some of the bHLH residues specifying these activities have been identified, but a full understanding of their function has awaited further structural information. We report here the crystal structure of the transcription factor E47 bHLH domain bound to DNA. The bHLH of E47 is a parallel, four-helix bundle with structural features that distinguish it from the bHLH-zipper protein Max. The E47 dimer makes nonequivalent contacts to each half of the -CACCTG- binding site. Sequence discrimination at the center of the E box may result from interaction with both the DNA bases and the phosphodiester backbone.

Integrase (IN) is an essential retroviral enzyme, and human transcriptional coactivator p75, which is also referred to as lens epithelium-derived growth factor (LEDGF), is the dominant cellular binding partner of HIV-1 IN. Here, we report the crystal structure of the dimeric catalytic core domain of HIV-1 IN complexed to the IN-binding domain of LEDGF. Previously identified LEDGF hotspot residues anchor the protein to both monomers at the IN dimer interface. The principal structural features of IN that are recognized by the host factor are the backbone conformation of residues 168–171 from one monomer and a hydrophobic patch that is primarily comprised of α-helices 1 and 3 of the second IN monomer. Inspection of diverse retroviral primary and secondary sequence elements helps to explain the apparent lentiviral tropism of the LEDGF-IN interaction. Because the lethal phenotypes of HIV-1 mutant viruses unable to interact with LEDGF indicate that IN function is highly sensitive to perturbations of the structure around the LEDGF-binding site, we propose that small molecule inhibitors of the protein–protein interaction might similarly disrupt HIV-1 replication.

We used a multiplexed approach based on flow-stretched DNA to monitor the enzymatic digestion of λ-phage DNA by individual bacteriophage λ exonuclease molecules. Statistical analyses of multiple single-molecule trajectories observed simultaneously reveal that the catalytic rate is dependent on the local base content of the substrate DNA. By relating single-molecule kinetics to the free energies of hydrogen bonding and base stacking, we establish that the melting of a base from the DNA is the rate-limiting step in the catalytic cycle. The catalytic rate also exhibits large fluctuations independent of the sequence, which we attribute to conformational changes of the enzyme-DNA complex.

Human XPF–ERCC1 is a DNA endonuclease that incises a damaged DNA strand on the 5′ side of a lesion during nucleotide excision repair and has additional role(s) in homologous recombination and DNA interstrand crosslink repair. We show that a truncated form of XPF lacking the N-terminal helicase-like domain in complex with ERCC1 exhibits a structure-specific endonuclease activity with similar specificity to that of full-length XPF–ERCC1. Two domains of ERCC1, a central domain and a C-terminal tandem helix–hairpin–helix (HhH 2 ) dimerization domain, bind to ssDNA. The central domain of ERCC1 binds ssDNA/dsDNA junctions with a defined polarity, preferring a 5′ single-stranded overhang. The XPF–ERCC1 HhH 2 domain heterodimer contains two independent ssDNA-binding surfaces, which are revealed by a crystal structure of the protein complex. A crystal structure of the central domain of ERCC1 shows its fold is strikingly similar to that of the nuclease domains of the archaeal Mus81/XPF homologs, despite very low sequence homology. A groove lined with basic and aromatic residues on the surface of ERCC1 has apparently been adapted to interact with ssDNA. On the basis of these crystallographic and biochemical studies, we propose a model in which XPF–ERCC1 recognizes a branched DNA substrate by binding the two ssDNA arms with the two HhH 2 domains of XPF and ERCC1 and by binding the 5′-ssDNA arm with the central domain of ERCC1.