The proliferative life-span of the stem cells that sustain hematopoiesis throughout life is not known. It has been proposed that the sequential loss of telomeric DNA from the ends of human chromosomes with each somatic cell division eventually reaches a critical point that triggers cellular senescence. We now show that candidate human stem cells with a CD34+CD38lo phenotype that were purified from adult bone marrow have shorter telomeres than cells from fetal liver or umbilical cord blood. We also found that cells produced in cytokine-supplemented cultures of purified precursor cells show a proliferation-associated loss of telomeric DNA. These findings strongly suggest that the proliferative potential of most, if not all, hematopoietic stem cells is limited and decreases with age, a concept that has widespread implications for models of normal and abnormal hematopoiesis as well as gene therapy.

Abstract To develop a purification strategy for isolating the most primitive hematopoietic stem cells present in normal human marrow we have combined cell separation techniques with an assay for cells that initiate sustained hematopoiesis in vitro in the presence of irradiated human marrow adherent cells. These “feeders” were established by subculturing 2- to 6-week-old primary long-term marrow culture adherent layers at a density of 3 x 10(4) irradiated cells per square centimeter. Test “long-term culture (LTC)-initiating cells” were plated on top of the feeders and the cocultures then maintained as standard long-term marrow cultures with half-media changes and removal of half of the nonadherent cells each week. The total number of myeloid, erythroid, and multilineage clonogenic progenitors present after 5 weeks was used to provide a quantitative assessment of the number of LTC-initiating cells originally added. Using this assay, the density, light scatter, and two cell surface antigen properties of LTC- initiating cells have been defined and compared with cells capable of directly forming colonies in methylcellulose. While the majority of the clonogenic cells were found in the high forward light scatter (FLS) “blast” window, LTC-initiating cells had significantly lower FLS properties and in this respect were more similar to lymphocytes. LTC- initiating cells also expressed less HLA-DR antigen than clonogenic cells. The majority of LTC-initiating cells were found in the top 2% of the CD34 (My10) fluorescence profile, whereas clonogenic cells were found throughout the top 5% of the CD34 fluorescence profile. By combining low FLS, low orthogonal light scatter (OLS), low HLA-DR expression, and high CD34 expression, a population could be obtained that was enriched for LTC-initiating cells approximately 800-fold over unseparated marrow. This population contains only 0.06% of the marrow cells and 2% of the total clonogenic cells, but retains 50% to 60% of the LTC-initiating cells present in the original marrow. The ability to purify these two populations independently shows that the LTC and clonogenic assays identify distinct, although not necessarily nonoverlapping cell types in human marrow. Since clonogenic cells are derived from LTC-initiating cells, the LTC assay clearly detects a more primitive population. The availability of a simple approach that allows the purification of such cells by three orders of magnitude in high yield should be useful for the investigation of early events in hematopoiesis as well as for the definitive isolation of human hematopoietic stem cells with long-term in vivo repopulating potential.

Class I homeobox (Hox) genes encode a major group of transcription factors controlling embryonic development and have been implicated in the continuing process of hematopoietic cell differentiation. They are clustered on four chromosomes and, in early development, exhibit spatially restricted expression with respect to their 3'-->5' chromosomal position. By using an improved PCR-based method for amplifying total cDNA derived from limited cell numbers, we now describe the expression of class I Hox genes in highly purified CD34+ cell subpopulations isolated from normal human bone marrow that represent functionally distinct stem and progenitor cell compartments. Our data indicate that at least 16 different Hox genes, mainly from the A and the B clusters, are expressed in one or more of these subpopulations of human hematopoietic cells. Moreover, markedly elevated expression of some of the Hox genes found at the 3' end of the A and B clusters (e.g., HoxB3) was a unique feature of the subpopulations that contained the most primitive functionally defined cells, whereas genes located in the 5' region of each cluster (e.g., HoxA10) were found to be expressed at nearly equal levels in the CD34+ subpopulations analyzed. In contrast to the findings for CD34+ cells, expression of two selected Hox genes, HoxB3 and HoxA10, was virtually extinguished in the CD34- fraction of bone marrow cells. These results demonstrate the expression of a broad range of Hox genes in primitive hematopoietic cells and point to the existence of a regulated program of Hox gene expression during their normal development.

Blood cells originate from hematopoietic stem cells that are located at different sites during ontogeny. Production of human stem cells and their progeny in culture is expected to have important implications for experimental therapeutic strategies involving gene transfer and transplantation. Here we report striking differences between primitive hematopoietic cells purified from adult bone marrow, umbilical cord blood, and fetal liver in cytokine-supplemented, serum-free cultures. In such cultures both the fraction of responding cells and their ability to produce CD34+ progenitor cells decreased markedly with the age of the cell donor. These results document extensive, ontogeny-related functional differences between primitive hematopoietic cells.

The loss of telomeric DNA may serve as a mitotic clock which signals cell senescence and exit from cell cycle. Telomerase, an enzyme which synthesizes telomeric repeats de novo, is required to maintain telomere lengths. In humans, significant telomerase activity has been found in cells with essentially unlimited replicative potential such as reproductive cells in ovaries and testes, immortal cell lines and cancer tissues, but not in most normal somatic cells or tissues. We have now examined telomerase expression in subpopulations of hematopoietic cells from adult human bone marrow using a sensitive polymerase chain reaction-based telomeric repeat amplification protocol. Telomerase activity was found at low levels in the highly enriched primitive hematopoietic cells (CD34+CD71loCD45RAlo) and was increased transiently when these cells were cultured in the presence of a mixture of cytokines. In contrast, the early progenitors (CD34+CD71+) expressed telomerase activity at a higher level which was subsequently downregulated in response to cytokines. Telomerase activity remained low in the more mature CD34− cells upon exposure to cytokines. Taken together, our results suggest that telomerase is expressed at a basal level in all hematopoietic cell populations examined, is induced in a primitive subset of hematopoietic progenitor cells and is downregulated upon further proliferation and differentiation of these cells. We have previously observed telomere shortening in cytokine-stimulated primitive hematopoietic cells. The low and transient activation of telomerase activity described here thus appears insufficient to maintain telomere lengths in cultured hematopoietic cells.