Both activating and null mutations of proteins required for canonical WNT signaling have revealed the importance of this pathway for normal skeletal development. However, tissue-specific transcriptional mechanisms through which WNT signaling promotes the differentiation of bone-forming cells have yet to be identified. Here, we address the hypothesis that canonical WNT signaling and the bone-related transcription factor RUNX2/CBFA1/AML3 are functionally linked components of a pathway required for the onset of osteoblast differentiation. Our findings show that, in bone of the SFRP1 (secreted frizzled-related protein-1)-null mouse, which exhibits activated WNT signaling and a high bone mass phenotype, there is a significant increase in expression of T-cell factor (TCF)-1, Runx2, and the RUNX2 target gene osteocalcin. We demonstrate by mutational analysis that a functional TCF regulatory element responsive to canonical WNT signaling resides in the promoter of the Runx2 gene (–97 to –93). By chromatin immunoprecipitation, recruitment of β-catenin and TCF1 to the endogenous Runx2 gene is shown. Coexpression of TCF1 with canonical WNT proteins resulted in a 2–5-fold activation of Runx2 promoter activity and a 7–8-fold induction of endogenous mRNA in mouse pluripotent mesenchymal and osteoprogenitor cells. This enhancement was abrogated by SFRP1. Taken together, our results provide evidence for direct regulation of Runx2 by canonical WNT signaling and suggest that Runx2 is a target of β-catenin/TCF1 for the stimulation of bone formation. We propose that WNT/TCF1 signaling, like bone morphogenetic protein/transforming growth factor-β signaling, activates Runx2 gene expression in mesenchymal cells for the control of osteoblast differentiation and skeletal development. Both activating and null mutations of proteins required for canonical WNT signaling have revealed the importance of this pathway for normal skeletal development. However, tissue-specific transcriptional mechanisms through which WNT signaling promotes the differentiation of bone-forming cells have yet to be identified. Here, we address the hypothesis that canonical WNT signaling and the bone-related transcription factor RUNX2/CBFA1/AML3 are functionally linked components of a pathway required for the onset of osteoblast differentiation. Our findings show that, in bone of the SFRP1 (secreted frizzled-related protein-1)-null mouse, which exhibits activated WNT signaling and a high bone mass phenotype, there is a significant increase in expression of T-cell factor (TCF)-1, Runx2, and the RUNX2 target gene osteocalcin. We demonstrate by mutational analysis that a functional TCF regulatory element responsive to canonical WNT signaling resides in the promoter of the Runx2 gene (–97 to –93). By chromatin immunoprecipitation, recruitment of β-catenin and TCF1 to the endogenous Runx2 gene is shown. Coexpression of TCF1 with canonical WNT proteins resulted in a 2–5-fold activation of Runx2 promoter activity and a 7–8-fold induction of endogenous mRNA in mouse pluripotent mesenchymal and osteoprogenitor cells. This enhancement was abrogated by SFRP1. Taken together, our results provide evidence for direct regulation of Runx2 by canonical WNT signaling and suggest that Runx2 is a target of β-catenin/TCF1 for the stimulation of bone formation. We propose that WNT/TCF1 signaling, like bone morphogenetic protein/transforming growth factor-β signaling, activates Runx2 gene expression in mesenchymal cells for the control of osteoblast differentiation and skeletal development. During development of the skeleton and formation of bone tissue, several morphogenic growth factor and hormone signaling pathways impinge upon transcriptional regulators to induce the osteogenic phenotype (1Karaplis A. Bilezikian J.P. Raisz L.G. Rodan G.A. Principles of Bone Biology. Academic Press, Inc., San Diego, CA2002: 33-58Google Scholar, 2Lian J.B. Stein G.S. Aubin J.E. Favus M.J. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. American Society for Bone and Mineral Research, Washington, D. C.2003: 13-28Google Scholar). The challenge is to identify how developmental cues and regulatory factors are integrated to accommodate the requirements for biological control of cell differentiation and tissue formation. Here, we have addressed the interaction of two key signals for osteogenesis: the WNT pathway, which contributes to the development of skeletal structures (3Church V.L. Francis-West P. Int. J. Dev. Biol. 2002; 46: 927-936PubMed Google Scholar, 4Westendorf J.J. Kahler R.A. Schroeder T.M. Gene (Amst.). 2004; 341: 19-39Crossref PubMed Scopus (677) Google Scholar), and the transcription factor RUNX2 (CBFA1/AML3), which is required for embryonic bone formation (5Komori T. J. Cell. Biochem. 2005; 95: 445-453Crossref PubMed Scopus (274) Google Scholar, 6Kobayashi T. Kronenberg H. Endocrinology. 2005; 146: 1012-1017Crossref PubMed Scopus (137) Google Scholar). WNT signaling comprises a family of 19 secreted glycoproteins that have functions related to cell specification, formation of the body plan, cell growth, differentiation and apoptosis (7Pandur P. Maurus D. Kuhl M. BioEssays. 2002; 24: 881-884Crossref PubMed Scopus (168) Google Scholar, 8Logan C.Y. Nusse R. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004; 20: 781-810Crossref PubMed Scopus (4239) Google Scholar). WNT proteins function through Frizzled receptors, which transduce the signal through either the canonical β-catenin pathway or non-canonical pathway (7Pandur P. Maurus D. Kuhl M. BioEssays. 2002; 24: 881-884Crossref PubMed Scopus (168) Google Scholar, 8Logan C.Y. Nusse R. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004; 20: 781-810Crossref PubMed Scopus (4239) Google Scholar). Activation of the Frizzled receptor complex results in inhibition of a phosphorylation cascade that stabilizes intracellular β-catenin levels. β-Catenin is subsequently translocated to the nucleus to form a transcriptionally active heterodimeric β-catenin TCF 2The abbreviations used are: TCF, T-cell factor; LEF, lymphoid enhancer factor; BMP, bone morphogenetic protein; MEF, mouse embryonic fibroblast; WT, wild-type; RT, reverse transcription; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. lymphoid enhancer factor (LEF) DNA-binding complex. Both gain- and loss-of-function mutations in canonical and non-canonical WNT signaling components have revealed critical requirements of WNT proteins for normal skeletogenesis (3Church V.L. Francis-West P. Int. J. Dev. Biol. 2002; 46: 927-936PubMed Google Scholar, 4Westendorf J.J. Kahler R.A. Schroeder T.M. Gene (Amst.). 2004; 341: 19-39Crossref PubMed Scopus (677) Google Scholar). Altered expression of several WNT proteins (WNT3a, WNT4, WNT5a, WNT7a, and WNT14/9a) causes defects in somite formation, chondrogenesis, limb development, and endochondral bone formation (9Ikeya M. Takada S. Mech. Dev. 2001; 103: 27-33Crossref PubMed Scopus (124) Google Scholar, 10Hartmann C. Tabin C.J. Cell. 2001; 104: 341-351Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (411) Google Scholar, 11Hartmann C. Tabin C.J. Development (Camb.). 2000; 127: 3141-3159Crossref PubMed Google Scholar, 12Yamaguchi T.P. Bradley A. McMahon A.P. Jones S. Development (Camb.). 1999; 126: 1211-1223PubMed Google Scholar, 13Adamska M. MacDonald B.T. Sarmast Z.H. Oliver E.R. Meisler M.H. Dev. Biol. 2004; 272: 134-144Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar). Recently, a rare human genetic disorder (tetra-amaelia) characterized by absence of all limbs has been linked to mutation in Wnt3 (14Niemann S. Zhao C. Pascu F. Stahl U. Aulepp U. Niswander L. Weber J.L. Muller U. Am. J. Hum. Genet. 2004; 74: 558-563Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (217) Google Scholar). More direct effects mediated through canonical WNT signaling on formation and turnover of the mature skeleton have been revealed. An activating mutation in the WNT coreceptor LRP5 (low density lipoprotein receptor-related protein-5) results in the high bone mass trait in humans (15Boyden L.M. Mao J. Belsky J. Mitzner L. Farhi A. Mitnick M.A. Wu D. Insogna K. Lifton R.P. N. Engl. J. Med. 2002; 346: 1513-1521Crossref PubMed Scopus (1335) Google Scholar, 16Little R.D. Recker R.R. Johnson M.L. N. Engl. J. Med. 2002; 347: 943-944Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar), a phenotype that is reproduced in the mouse model (17Akhter M.P. Wells D.J. Short S.J. Cullen D.M. Johnson M.L. Haynatzki G.R. Babij P. Allen K.M. Yaworsky P.J. Bex F. Recker R.R. Bone (N. Y.). 2004; 35: 162-169Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar, 18Babij P. Zhao W. Small C. Kharode Y. Yaworsky P.J. Bouxsein M.L. Reddy P.S. Bodine P.V. Robinson J.A. Bhat B. Marzolf J. Moran R.A. Bex F. J. Bone Miner. Res. 2003; 18: 960-974Crossref PubMed Scopus (444) Google Scholar). Consistent with this phenotype, the LRP5 loss-of-function mutation exhibits osteopenia and decreased bone mass in humans (19Gong Y. Slee R.B. Fukai N. Rawadi G. Roman-Roman S. Reginato A.M. Wang H. Cundy T. Glorieux F.H. Lev D. Zacharin M. Oexle K. Marcelino J. Suwairi W. Heeger S. Sabatakos G. Apte S. Adkins W.N. Allgrove J. Arslan-Kirchner M. Batch J.A. Beighton P. Black G.C. Boles R.G. Boon L.M. Borrone C. Brunner H.G. Carle G.F. Dallapiccola B. De Paepe A. Floege B. Halfhide M.L. Hall B. Hennekam R.C. Hirose T. Jans A. Juppner H. Kim C.A. Keppler-Noreuil K. Kohlschuetter A. LaCombe D. Lambert M. Lemyre E. Letteboer T. Peltonen L. Ramesar R.S. Romanengo M. Somer H. Steichen-Gersdorf E. Steinmann B. Sullivan B. Superti-Furga A. Swoboda W. van den Boogaard M.J. van Hul W. Vikkula M. Votruba M. Zabel B. Garcia T. Baron R. Olsen B.R. Warman M.L. Cell. 2001; 107: 513-523Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1858) Google Scholar) and in a mouse model (20Kato M. Patel M.S. Levasseur R. Lobov I. Chang B.H. Glass D.A. Hartmann C. Li L. Hwang T.H. Brayton C.F. Lang R.A. Karsenty G. Chan L. J. Cell Biol. 2002; 157: 303-314Crossref PubMed Scopus (943) Google Scholar). Targeted disruption of axin-2 (a negative regulator of the canonical WNT pathway) in mice leads to increased osteoblast differentiation and matrix mineralization (21Yu H.M. Jerchow B. Sheu T.J. Liu B. Costantini F. Puzas J.E. Birchmeier W. Hsu W. Development (Camb.). 2005; 132: 1995-2005Crossref PubMed Scopus (274) Google Scholar). Embryonic lethality of the β-catenin-null mouse (22Haegel H. Larue L. Ohsugi M. Fedorov L. Herrenknecht K. Kemler R. Development (Camb.). 1995; 121: 3529-3537Crossref PubMed Google Scholar), lack of skeletal structures derived from the cranial neural crest (23Brault V. Moore R. Kutsch S. Ishibashi M. Rowitch D.H. McMahon A.P. Sommer L. Boussadia O. Kemler R. Development (Camb.). 2001; 128: 1253-1264PubMed Google Scholar), and arrest of osteoblast differentiation (24Day T.F. Guo X. Garrett-Beal L. Yang Y. Developmental Cell. 2005; 8: 739-750Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1346) Google Scholar, 25Hill T.P. Spater D. Taketo M.M. Birchmeier W. Hartmann C. Developmental Cell. 2005; 8: 727-738Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (915) Google Scholar, 26Holmen S.L. Zylstra C.R. Mukherjee A. Sigler R.E. Faugere M.C. Bouxsein M.L. Deng L. Clemens T.L. Williams B.O. J. Biol. Chem. 2005; 280: 21162-21168Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (512) Google Scholar) in conditional β-catenin mutants as well as transgenic mouse models (27Tamamura Y. Otani T. Kanatani N. Koyama E. Kitagaki J. Komori T. Yamada Y. Costantini F. Wakisaka S. Pacifici M. Iwamoto M. Enomoto-Iwamoto M. J. Biol. Chem. 2005; 280: 19185-19195Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (278) Google Scholar) demonstrate the importance of the canonical WNT pathway during early developmental stages and for bone formation. The WNT pathway is negatively regulated by several modulators, including secreted frizzled-related proteins (SFRPs), which contain a cysteine-rich domain for interaction with WNT proteins, thereby preventing them from interacting with the membrane-bound receptor Frizzled and/or coreceptor LRP5/6 (28Kawano Y. Kypta R. J. Cell Sci. 2003; 116: 2627-2634Crossref PubMed Scopus (1360) Google Scholar). A null mutation of the WNT antagonist SFRP1 in mouse also results in high bone mass between the ages of 7 and 9 months (29Bodine P.V. Zhao W. Kharode Y.P. Bex F.J. Lambert A.J. Goad M.B. Gaur T. Stein G.S. Lian J.B. Komm B.S. Mol. Endocrinol. 2004; 18: 1222-1237Crossref PubMed Scopus (406) Google Scholar), suggesting very selective effects exhibited by either SFRP1 or specific WNT proteins in maintaining the bone mass of the adult skeleton. RUNX2, a member of the runt homology domain transcription factor family, is essential for osteoblast differentiation (5Komori T. J. Cell. Biochem. 2005; 95: 445-453Crossref PubMed Scopus (274) Google Scholar, 6Kobayashi T. Kronenberg H. Endocrinology. 2005; 146: 1012-1017Crossref PubMed Scopus (137) Google Scholar, 30Banerjee C. McCabe L.R. Choi J.-Y. Hiebert S.W. Stein J.L. Stein G.S. Lian J.B. J. Cell. Biochem. 1997; 66: 1-8Crossref PubMed Scopus (398) Google Scholar, 31Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3647) Google Scholar). Mutations in the Runx2 gene in mouse and human are associated with cleidocranial dysplasia and critical defects in bone formation (32Komori T. Yagi H. Nomura S. Yamaguchi A. Sasaki K. Deguchi K. Shimizu Y. Bronson R.T. Gao Y.-H. Inada M. Sato M. Okamoto R. Kitamura Y. Yoshiki S. Kishimoto T. Cell. 1997; 89: 755-764Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3653) Google Scholar, 33Otto F. Thornell A.P. Crompton T. Denzel A. Gilmour K.C. Rosewell I.R. Stamp G.W.H. Beddington R.S.P. Mundlos S. Olsen B.R. Selby P.B. Owen M.J. Cell. 1997; 89 (W. H.R. S. P.): 765-771GAbstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2412) Google Scholar, 34Choi J.-Y. Pratap J. Javed A. Zaidi S.K. Xing L. Balint E. Dalamangas S. Boyce B. van Wijnen A.J. Lian J.B. Stein J.L. Jones S.N. Stein G.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 8650-8655Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar, 35Otto F. Kanegane H. Mundlos S. Hum. Mutat. 2002; 19: 209-216Crossref PubMed Scopus (236) Google Scholar, 36Yoshida T. Kanegane H. Osato M. Yanagida M. Miyawaki T. Ito Y. Shigesada K. Blood Cells Mol. Dis. 2003; 30: 184-193Crossref PubMed Scopus (42) Google Scholar). RUNX2 functions as a master regulatory factor, in part by interacting with a variety of coregulatory proteins and forming multimeric complexes that determine whether RUNX2 will act as a transactivator or repressor on target genes during cell differentiation (6Kobayashi T. Kronenberg H. Endocrinology. 2005; 146: 1012-1017Crossref PubMed Scopus (137) Google Scholar, 37Lian J.B. Javed A. Zaidi S.K. Lengner C. Montecino M. van Wijnen A.J. Stein J.L. Stein G.S. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 2004; 14: 1-41Crossref PubMed Google Scholar, 38Paredes R. Arriagada G. Cruzat F. Villagra A. Olate J. Zaidi K. van Wijnen A.J. Lian J.B. Stein G.S. Stein J.L. Montecino M. Mol. Cell. Biol. 2004; 24: 8847-8861Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar). RUNX factors also integrate signaling responses from morphogenetic signals and the extracellular matrix by forming coregulatory complexes, for example, with Smad proteins, mediators of bone morphogenetic protein (BMP)/transforming growth factor-β signaling, and with intracellular adaptor proteins such as Yes-associated protein that transduce c-Src kinase signaling (39Afzal F. Pratap J. Ito K. Ito Y. Stein J.L. van Wijnen A.J. Stein G.S. Lian J.B. Javed A. J. Cell. Physiol. 2005; 204: 63-72Crossref PubMed Scopus (127) Google Scholar, 40Zaidi S.K. Sullivan A.J. van Wijnen A.J. Stein J.L. Stein G.S. Lian J.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: 8048-8053Crossref PubMed Scopus (187) Google Scholar, 41Zaidi S.K. Sullivan A.J. Medina R. Ito Y. van Wijnen A.J. Stein J.L. Lian J.B. Stein G.S. EMBO J. 2004; 23: 790-799Crossref PubMed Scopus (321) Google Scholar). Several significant observations led us to consider that Runx2 may be a target of WNT signaling for early specification of the osteoblast lineage. First, the Runx2 gene is expressed early in the embryo in mesenchyme that gives rise to skeletal elements prior to the formation of bone tissue (31Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3647) Google Scholar, 33Otto F. Thornell A.P. Crompton T. Denzel A. Gilmour K.C. Rosewell I.R. Stamp G.W.H. Beddington R.S.P. Mundlos S. Olsen B.R. Selby P.B. Owen M.J. Cell. 1997; 89 (W. H.R. S. P.): 765-771GAbstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2412) Google Scholar, 42Lengner C.J. Drissi H. Choi J.-Y. van Wijnen A.J. Stein J.L. Stein G.S. Lian J.B. Mech. Dev. 2002; 114: 167-170Crossref PubMed Scopus (57) Google Scholar). Second, although BMP2 induction of bone formation and osteoblast differentiation is accompanied by Runx2 gene expression, 3-kb Runx2 promoter-lacZ transgene expression in vivo is restricted to prechondrogenic mesenchyme (42Lengner C.J. Drissi H. Choi J.-Y. van Wijnen A.J. Stein J.L. Stein G.S. Lian J.B. Mech. Dev. 2002; 114: 167-170Crossref PubMed Scopus (57) Google Scholar). These findings suggest that signals other than the osteogenic BMP2 pathway are operative on the promoter for expression of Runx2 in early mesenchyme during embryonic development. In this study, we show that the Runx2 gene is a direct target of the canonical WNT signaling pathway. Activation of the Runx2 promoter through a TCF site was observed in mouse embryonic fibroblasts and pluripotent mesenchymal and osteoprogenitor cells in vitro. Notably, endogenous Runx2 and TCF1 were up-regulated in the SFRP1-null mouse, which exhibits increased WNT signaling and osteoblast differentiation. We propose that direct regulation of Runx2 gene expression in vivo by canonical WNT signaling is a contributing factor for early skeletal development and for sustaining bone mass in the adult. Mice—Transgenic mice containing the lacZ gene under the control of the 3-kb Runx2 P1 promoter (42Lengner C.J. Drissi H. Choi J.-Y. van Wijnen A.J. Stein J.L. Stein G.S. Lian J.B. Mech. Dev. 2002; 114: 167-170Crossref PubMed Scopus (57) Google Scholar) and SFRP1 knockout (sfrp1–/–) and wild-type (sfrp1+/+) mice (29Bodine P.V. Zhao W. Kharode Y.P. Bex F.J. Lambert A.J. Goad M.B. Gaur T. Stein G.S. Lian J.B. Komm B.S. Mol. Endocrinol. 2004; 18: 1222-1237Crossref PubMed Scopus (406) Google Scholar) were used for in vivo analysis. Animals were maintained at the University of Massachusetts following procedures approved by the Institutional Animal Care and Use Committees. Genotyping was carried out as described previously for both mouse models (29Bodine P.V. Zhao W. Kharode Y.P. Bex F.J. Lambert A.J. Goad M.B. Gaur T. Stein G.S. Lian J.B. Komm B.S. Mol. Endocrinol. 2004; 18: 1222-1237Crossref PubMed Scopus (406) Google Scholar, 42Lengner C.J. Drissi H. Choi J.-Y. van Wijnen A.J. Stein J.L. Stein G.S. Lian J.B. Mech. Dev. 2002; 114: 167-170Crossref PubMed Scopus (57) Google Scholar). Cell Culture—Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were isolated from postcoitus day 12.5 mice as described previously (43Lengner C.J. Lepper C. van Wijnen A.J. Stein J.L. Stein G.S. Lian J.B. J. Cell. Physiol. 2004; 200: 327-333Crossref PubMed Scopus (68) Google Scholar). Briefly, each embryo was sheared in an 18-gauge syringe in the presence of 1 ml 0.25% trypsin and 1 mm EDTA (Invitrogen). After a 15-min incubation at 37 °C, Dulbecco's modified Eagle's medium with 15% fetal bovine serum was added to inactivate trypsin. The cells were plated and incubated for 24 h at 37 °C. The adherent cells were used as MEF cells. The experiments were initiated after replating the adherent cells in 6-well plates, followed by treatment for 48 h with recombinant human BMP2 (kindly provided by Dr. John Wozney, Wyeth Research, Cambridge, MA) in WNT3-conditioned medium (collected from WNT3a-overex-pressing L-cells obtained from American Type Culture Collection). Cells were harvested either for histochemical detection of β-galactosidase activity after fixation in 0.5% glutaraldehyde (29Bodine P.V. Zhao W. Kharode Y.P. Bex F.J. Lambert A.J. Goad M.B. Gaur T. Stein G.S. Lian J.B. Komm B.S. Mol. Endocrinol. 2004; 18: 1222-1237Crossref PubMed Scopus (406) Google Scholar) or for biochemical assay by addition of 300 μlof1× reporter lysis buffer (Promega Corp.). A 50-μl aliquot of the lysates was incubated with 100 μlof1× reporter lysis buffer and 150 μl of substrate solution (80 mm phosphate-buffered saline (pH 7.3), 102 mm 2-mercaptoethanol, 9 mm MgCl2, and 8 mm o-nitrophenyl β-galactopyranoside) for 30 min at 37 °C. The reaction was stopped by addition of 500 μlof1 m sodium carbonate, and absorbance was read at 410 nm. Mouse osteoprogenitor MC3T3 clone E1, pluripotent C3H10T1/2, and fibroblastic NIH3T3 cells were used in this study. Cells were cultured in 6-well plates in α-minimal essential medium (for MC3T3 E1 cells) or in Dulbecco's modified Eagle's medium (for C3H10T1/2 cells) supplemented with 10% fetal bovine serum (Hyclone Laboratories), 1 mm l-glutamine, and 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen). For differentiation studies, MC3T3 E1 cells were fed every 2nd day at confluence with the above medium containing 10 mm β-glycerol phosphate and 50 μg/ml ascorbic acid. Expression Constructs, Transfection, and Luciferase Assay—For transfection studies, MC3T3-E1, C3H10T1/2, and NIH3T3 cells at 60–70% confluence were treated with FuGENE 6 transfection reagent (Roche Applied Science) at a 1:3 ratio of DNA to reagent following the manufacturer's instructions. The 3-kb mouse proximal Runx2 promoter or the 0.6-kb proximal promoter of mouse and rat (upstream P1 promoter; MASNS isoform) fused to the firefly luciferase reporter was used in transfection assays (44Drissi H. Luc Q. Shakoori R. Chuva de Sousa Lopes S. Choi J.-Y. Terry A. Hu M. Jones S. Neil J.C. Lian J.B. Stein J.L. van Wijnen A.J. Stein G.S. J. Cell. Physiol. 2000; 184: 341-350Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar). The mutation in the TCF1-binding site was created using the QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene) following the manufacturer's instructions. The expression constructs for hemagglutinin-tagged WNT proteins and TCF1 were obtained from Upstate Biotechnology, Inc. sfrp1 was amplified and cloned into pcDNA3.1(–) as an EcoRI/KpnI fragment. The cytomegalovirus promoter-driven β-galactosidase reporter gene (pCMVβ) was obtained from BD Biosciences, and the plasmid (100 ng/well in a 6-well plate) was cotransfected to normalize the transfection efficiency. The total amount of transfected DNA was kept constant by using the respective empty vectors as filler DNA. The cells were harvested after 24 h in 1× reporter lysis buffer for promoter activity studies. The luciferase activity was measured using a luciferase assay kit (Promega). Luciferase activities were normalized for transfection efficiency to β-galactosidase activity in a colorimetric assay of the same cell lysates as described above. The mean values (n = 6) for each transfection experiment (performed at least twice) were plotted for relative luciferase values along with S.D. shown as error bars. Western Blot Analysis—Cells were harvested in direct lysis buffer (10 mm Tris (pH 7.5), 2% SDS, 10 mm dithiothreitol, 10% glycerol, 2 m urea, 1× protease inhibitor, 0.2 m phenylmethylsulfonyl fluoride, and 2 mg/ml bromphenol blue), and equal amounts of total protein were resolved on 10% SDS-polyacrylamide gel to confirm the expression levels of the expressed constructs by detecting hemagglutinin-tagged protein (data not shown). The primary antibodies used were as follows: mouse monoclonal anti-RUNX2 (1:2000) (45Zhang Y.W. Yasui N. Ito K. Huang G. Fujii M. Hanai J. Nogami H. Ochi T. Miyazono K. Ito Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 10549-10554Crossref PubMed Scopus (309) Google Scholar) and horseradish peroxidase-conjugated hemagglutinin (1:2000), anti-TCF1 (1:1000), and anti-β-actin (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Blots were incubated for 1 h at room temperature with primary antibody in 2% milk and subsequently with horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse secondary antibody. The signal was detected using a Luminescence detection kit (PerkinElmer Life Sciences). Femur bones from wild-type (WT) and sfrp1–/– mice at 7 months of age were harvested. The marrow was first flushed from the bone, and the diaphysis region was crushed in the frozen state in a metal plate tissue homogenizer and then boiled in sample buffer for western analysis essentially as described above. RNA Isolation and Quantitative Reverse Transcription (RT)-PCR— MC3T3 cells were harvested in 300 μl of TRIzol reagent (Invitrogen), and total RNA was isolated from the cells following the manufacturer's instructions. Marrow-free femur bones from 1- and 7-month-old mice were frozen in liquid nitrogen, pulverized, and resuspended in 5 ml of TRIzol, and total RNA was extracted following the manufacturer's instructions. Any potential DNA contamination was removed by RNase-free DNase treatment. The RT reaction was performed on 1 μg of total RNA using a first strand synthesis kit (Invitrogen). Relative transcript levels were measured by real-time PCR in a 50-μl reaction volume on 96-well plates using an ABI PRISM 7000 sequence detection system (Applied Biosystems) following the recommended protocol for SYBR Green (Bio-Rad). Transcript levels were normalized to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) levels using primers from Applied Biosystems and SYBR Green Master Mix (Bio-Rad). The primers used for amplification are listed in TABLE ONE.TABLE ONENucleotide sequences of primers used for quantitative RT-PCR detectionGenePrimer sequenceRunx25′-CGC CCC TCC CTG AAC TCT-3′ (forward)5′-TGC CTG CCT GGG ATC TGT A-3′ (reverse)TCF15′-CAG AAT CCA CAG ATA CAG CA-3′ (forward)5′-CAG CCT TTG AAA TCT TCA TC-3′ (reverse)LEF15′-AGT GCA GCT ATC AAC CAG AT-3′ (forward)5′-TTC ATA GTA TTT GGC CTG CT-3′ (reverse)Osteocalcin5′-CTG ACA AAG CCT TCA TGT CCA A-3′ (forward)5′-GCG CCG GAG TCT GTT CAC TA-3′ (reverse)Alkaline phosphatase5′-TTG TGC GAG AGA AAG GAG A-3′ (forward)5′-GTT TCA GGG CAT TTT TCA AGG T-3′ (reverse)Histone H45′-CCA GCT GGT GTT TCA GAT TAC A-3′ (forward)5′-ACC CTT GCC TAG ACC CTT TC-3′ (reverse)bcl25′-AAG CTG TCA CAG AGG GGC TA-3′ (forward)5′-CAG GCT GGA AGG AGA AGA TG-3′ (reverse) Open table in a new tab Electrophoretic Mobility Shift Assay—Nuclear extracts were prepared by hypotonic cell lysis and high salt nuclei extraction as described previously (46Javed A. Barnes G.L. Jassanya B.O. Stein J.L. Gerstenfeld L. Lian J.B. Stein G.S. Mol. Cell. Biol. 2001; 21: 2891-2905Crossref PubMed Scopus (163) Google Scholar). Oligonucleotides from the rat Runx2 promoter containing the binding site for LEF/TCF (WT and mutated at the TCF site, referred to as mTCF) were synthesized. The upper strand oligonucleotide (200 ng) was labeled with 32P for 1 h at 37°C using T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs Inc.) following the manufacturer's instructions. Annealing was performed in the presence of a 3-fold excess amount of the lower strand oligonucleotide. Labeled oligonucleotides were purified using a quick-spin Sephadex G-25 column (Roche Applied Science) following the manufacturer's protocol. Reaction mixtures for gel shift assay were prepared using 10 fmol of probe, 50 mm KCl, 12 mm HEPES, 1 mm EDTA, 1 mm dithiothreitol, 12% glycerol, 12.5 μg/ml salmon sperm DNA, and 5 μg of nuclear extracts. After a 20-min incubation at room temperature, 100-fold unlabeled double-stranded WT competitor oligonucleotide or nonspecific AP1 oligonucleotide was added to the reaction mixtures. For immunoshift assays, nuclear extract was incubated with either anti-TCF1 antibody (2 μg) or nonspecific control antibody (Sp1) at 37 °C for 1 h before addition of the probe. The samples were electrophoresed on a 4% nondenaturing polyacrylamide gel, dried, and autoradiographed on Biomax MR film (Eastman Kodak Co.). Chromatin Immunoprecipitation—Chromatin immunoprecipitation studies were performed as described previously (47Hovhannisyan H. Cho B. Mitra P. Montecino M. Stein G.S. van Wijnen A.J. Stein J.L. Mol. Cell. Biol. 2003; 23: 1460-1469Crossref PubMed Scopus (25) Google Scholar) with the following modifications. Formaldehyde cross-linking was quenched by addition of glycine to a final concentration of 125 mm at room temperature for 10 min, followed by washing once with ice-cold 1× phosphate-buffered saline before resuspension in lysis buffer. Sonication was performed eight times at setting 3 for 15 s. The precleared cell lysate was incubated overnight at 4 °C with 5 μg of anti-β-catenin antibody (Upstate Biotechnology, Inc.), 4 μg of anti-TCF1 and anti-LEF1 antibodies, or 3 μg of anti-RUNX2 antibody M-70 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). The cross-linking reaction was reversed by overnight incubation of the solutions at 65 °C, and the DNA was recovered by phenol/chloroform extractions. DNA was ethanol-precipitated and dissolved in 40 μl of Tris/EDTA. Four μl of DNA was used for quantitative RT-PCR to detect the presence of specific DNA segments with the following primer pairs: Set 1, CAGTGGTAGGCAGTCCCACTTTAC (forward) and GGCTGGTAGTGACCTGCAGAGAT (reverse); and Set 2, GAGCAAGGGGGAAGCCACAGTG (forward) and GTGAGGCGAATGAAGCATTCACAC (reverse). Runx2 Expression Is Induced by Enhanced WNT Signaling in Vivo—A biological linkage of Runx2 and WNT signaling was first established by examining the bone tissue of WT and sfrp1–/– mice. Inactivation of SFRP1 results in a highly significant increase in the mineral apposition rate and decreased apoptosis in 7–9-month-old sfrp1–/– mice, leading to higher bone density (29Bodine P.V. Zhao W. Kharode Y.P. Bex F.J. Lambert A.J. Goa

Estrogens are known to regulate the proliferation of breast cancer cells and to alter their cytoarchitectural and phenotypic properties, but the gene networks and pathways by which estrogenic hormones regulate these events are only partially understood. We used global gene expression profiling by Affymetrix GeneChip microarray analysis, with quantitative PCR verification in many cases, to identify patterns and time courses of genes that are either stimulated or inhibited by estradiol (E2) in estrogen receptor (ER)-positive MCF-7 human breast cancer cells. Of the >12,000 genes queried, over 400 showed a robust pattern of regulation, and, notably, the majority (70%) were down-regulated. We observed a general up-regulation of positive proliferation regulators, including survivin, multiple growth factors, genes involved in cell cycle progression, and regulatory factor-receptor loops, and the down-regulation of transcriptional repressors, such as Mad4 and JunB, and of antiproliferative and proapoptotic genes, including B cell translocation gene-1 and -2, cyclin G2, BCL-2 antagonist/killer 1, BCL 2-interacting killer, caspase 9, and TGFβ family growth inhibitory factors. These together likely contribute to the stimulation of proliferation and the suppression of apoptosis by E2 in these cells. Of interest, E2 appeared to modulate its own activity through the enhanced expression of genes involved in prostaglandin E production and signaling, which could lead to an increase in aromatase expression and E2 production, as well as the decreased expression of several nuclear receptor coactivators that could impact ER activity. Our studies highlight the diverse gene networks and metabolic and cell regulatory pathways through which this hormone operates to achieve its widespread effects on breast cancer cells.

High specific activity estradiol labeled with iodine-125 was used to detect approximately 200 saturable, high-affinity (dissociation constant ≅ 1.0 n M ) nuclear binding sites in rat (ROS 17/2.8) and human (HOS TE85) clonal osteoblast-like osteosarcoma cells. Of the steroids tested, only testosterone exhibited significant cross-reactivity with estrogen binding. RNA blot analysis with a complementary DNA probe to the human estrogen receptor revealed putative receptor transcripts of 6 to 6.2 kilobases in both rat and human osteosarcoma cells. Type I procollagen and transforming growth factor-β messenger RNA levels were enhanced in cultured human osteoblast-like cells treated with 1 n M estradiol. Thus, estrogen can act directly on osteoblasts by a receptor-mediated mechanism and thereby modulate the extracellular matrix and other proteins involved in the maintenance of skeletal mineralization and remodeling.

A preliminary expression profiling analysis of osteoblasts derived from tibia explants of the high bone mass LRP5 G171V transgenic mice demonstrated increased expression of canonical Wnt pathway and Wnt/β-catenin target genes compared with non-transgenic explant derived osteoblasts. Therefore, expression of Wnt/β-catenin target genes were monitored after in vivo loading of the tibia of LRP5 G171V transgenic mice compared with non-transgenic mice. Loading resulted in the increased expression of Wnt pathway and Wnt/β-catenin target genes including Wnt10B, SFRP1, cyclin D1, FzD2, WISP2, and connexin 43 in both genotypes; however, there was a further increased in transcriptional response with the LRP5 G171V transgenic mice. Similar increases in the expression of these genes (except cyclin D1) were observed when non-transgenic mice were pharmacologically treated with a canonical Wnt pathway activator, glycogen synthase kinase 3β inhibitor and then subjected to load. These in vivo results were further corroborated by in vitro mechanical loading experiments in which MC3T3-E1 osteoblastic cells were subjected to 3400 microstrain alone for 5 h, which increased the expression of Wnt10B, SFRP1, cyclin D1, FzD2, WISP2, and connexin 43. Furthermore, when MC3T3-E1 cells were treated with either glycogen synthase kinase 3β inhibitor or Wnt3A to activate Wnt signaling and then subjected to load, a synergistic up-regulation of these genes was observed compared with vehicle-treated cells. Collectively, the in vivo and in vitro mechanical loading results support that Wnt/β-catenin signaling is a normal physiological response to load and that activation of the Wnt/β-catenin pathway enhances the sensitivity of osteoblasts/osteocytes to mechanical loading.

Abstract Selective estrogen receptor modulators (SERMs) such as tamoxifen are effective in the treatment of many estrogen receptor-positive breast cancers and have also proven to be effective in the prevention of breast cancer in women at high risk for the disease. The comparative abilities of tamoxifen versus raloxifene in breast cancer prevention are currently being compared in the Study of Tamoxifen and Raloxifene trial. To better understand the actions of these compounds in breast cancer, we have examined their effects on the expression of ∼12,000 genes, using Affymetrix GeneChip microarrays, with quantitative PCR verification in many cases, categorizing their actions as agonist, antagonist, or partial agonist/antagonist. Analysis of gene stimulation and inhibition by the SERMs trans-hydroxytamoxifen (TOT) and raloxifene (Ral) or ICI 182,780 (ICI) and by estradiol (E2) in estrogen receptor-containing MCF-7 human breast cancer cells revealed that (a) TOT was the most E2-like of the three compounds, (b) all three compounds either partially or fully antagonized the action of E2 on most genes, with the order of antagonist activity being ICI > Ral > TOT, (c) TOT and Ral, but not ICI, displayed partial agonist/partial antagonist activity on a number of E2-regulated genes, (d) several stimulatory cell cycle-related genes were down-regulated exclusively by ICI, (e) the estrogen-like activity of Ral nearly always overlapped with that of TOT, indicating that Ral has little unique agonist activity different from that of TOT, and (f) some genes were specifically up-regulated by TOT but not Ral, ICI, or E2. Hence, gene expression profiling can discern fundamental differences among SERMs and provides insight into the distinct biologies of TOT, Ral, and ICI in breast cancer.