Significance It is increasingly apparent that bacteria in the gut are important determinants of health and disease in humans. However, we know remarkably little about how this organ transitions from a sterile/near-sterile state at birth to one that soon harbors a highly diverse biomass. We show in premature infants a patterned progression of the gut bacterial community that is only minimally influenced by mode of delivery, antibiotics, or feeds. The pace of this progression is most strongly influenced by gestational age, with the microbial population assembling slowest for infants born most prematurely. These data raise the possibility that host biology, more than exogenous factors such as antibiotics, feeds, and route of delivery, drives bacterial populations in the premature newborn infant gut.

Objective

 The technology for the growth of human intestinal epithelial cells is rapidly progressing. An exciting possibility is that this system could serve as a platform for individualised medicine and research. However, to achieve this goal, human epithelial culture must be enhanced so that biopsies from individuals can be used to reproducibly generate cell lines in a short time frame so that multiple, functional assays can be performed (ie, barrier function and host–microbial interactions). 

Design

 We created a large panel of human gastrointestinal epithelial cell lines (n=65) from patient biopsies taken during routine upper and lower endoscopy procedures. Proliferative stem/progenitor cells were rapidly expanded using a high concentration of conditioned media containing the factors critical for growth (Wnt3a, R-spondin and Noggin). A combination of lower conditioned media concentration and Notch inhibition was used to differentiate these cells for additional assays. 

Results

 We obtained epithelial lines from all accessible tissue sites within 2 weeks of culture. The intestinal cell lines were enriched for stem cell markers and rapidly grew as spheroids that required passage at 1:3–1:4 every 3 days. Under differentiation conditions, intestinal epithelial spheroids showed region-specific development of mature epithelial lineages. These cells formed functional, polarised monolayers covered by a secreted mucus layer when grown on Transwell membranes. Using two-dimensional culture, these cells also demonstrated novel adherence phenotypes with various strains of pathogenic Escherichia coli. 

Conclusions

 This culture system will facilitate the study of interindividual, functional studies of human intestinal epithelial cells, including host–microbial interactions.

Background Gut bacteria might predispose to or protect from necrotising enterocolitis, a severe illness linked to prematurity. In this observational prospective study we aimed to assess whether one or more bacterial taxa in the gut differ between infants who subsequently develop necrotising enterocolitis (cases) and those who do not (controls). Methods We enrolled very low birthweight (1500 g and lower) infants in the primary cohort (St Louis Children's Hospital) between July 7, 2009, and Sept 16, 2013, and in the secondary cohorts (Kosair Children's Hospital and Children's Hospital at Oklahoma University) between Sept 12, 2011 and May 25, 2013. We prospectively collected and then froze stool samples for all infants. Cases were defined as infants whose clinical courses were consistent with necrotising enterocolitis and whose radiographs fulfilled criteria for Bell's stage 2 or 3 necrotising enterocolitis. Control infants (one to four per case; not fixed ratios) with similar gestational ages, birthweight, and birth dates were selected from the population after cases were identified. Using primers specific for bacterial 16S rRNA genes, we amplified and then pyrosequenced faecal DNA from stool samples. With use of Dirichlet multinomial analysis and mixed models to account for repeated measures, we identified host factors, including development of necrotising enterocolitis, associated with gut bacterial populations. Findings We studied 2492 stool samples from 122 infants in the primary cohort, of whom 28 developed necrotising enterocolitis; 94 infants were used as controls. The microbial community structure in case stools differed significantly from those in control stools. These differences emerged only after the first month of age. In mixed models, the time-by-necrotising-enterocolitis interaction was positively associated with Gammaproteobacteria (p=0·0010) and negatively associated with strictly anaerobic bacteria, especially Negativicutes (p=0·0019). We studied 1094 stool samples from 44 infants in the secondary cohorts. 18 infants developed necrotising enterocolitis (cases) and 26 were controls. After combining data from all cohorts (166 infants, 3586 stools, 46 cases of necrotising enterocolitis), there were increased proportions of Gammaproteobacteria (p=0·0011) and lower proportions of both Negativicutes (p=0·0013) and the combined Clostridia–Negativicutes class (p=0·0051) in infants who went on to develop necrotising enterocolitis compared with controls. These associations were strongest in both the primary cohort and the overall cohort for infants born at less than 27 weeks' gestation. Interpretation A relative abundance of Gammaproteobacteria (ie, Gram-negative facultative bacilli) and relative paucity of strict anaerobic bacteria (especially Negativicutes) precede necrotising enterocolitis in very low birthweight infants. These data offer candidate targets for interventions to prevent necrotising enterocolitis, at least among infants born at less than 27 weeks' gestation. Funding National Institutes of Health (NIH), Foundation for the NIH, the Children's Discovery Institute.

Bacteria that cause late-onset neonatal sepsis often reside in the infant gut before they invade the bloodstream. They are rarely found in infants without sepsis. Screening, augmented hygiene, and specific pathogen decolonization might prevent bloodstream infections in premature infants. Background. Late-onset sepsis is a major problem in neonatology, but the habitat of the pathogens before bloodstream invasion occurs is not well established. Methods. We examined prospectively collected stools from premature infants with sepsis to find pathogens that subsequently invaded their bloodstreams, and sought the same organisms in stools of infants without sepsis. Culture-based techniques were used to isolate stool bacteria that provisionally matched the bloodstream organisms, which were then genome sequenced to confirm or refute commonality. Results. Of 11 children with late-onset neonatal bloodstream infections, 7 produced at least 1 stool that contained group B Streptococcus (GBS), Serratia marcescens, or Escherichia coli before their sepsis episode with provisionally matching organisms. Of 96 overlap comparison subjects without sepsis temporally associated with these cases, 4 were colonized with provisionally matching GBS or S. marcescens. Of 175 comparisons of stools from randomly selected infants without sepsis, 1 contained a GBS (this infant had also served as an overlap comparison subject and both specimens contained provisionally matching GBS). Genome sequencing confirmed common origin of provisionally matching fecal and blood isolates. The invasive E. coli were present in all presepticemic stools since birth, but gut colonization with GBS and S. marcescens occurred closer to time of bloodstream infection. Conclusions. The neonatal gut harbors sepsis-causing pathogens, but such organisms are not inevitable members of the normal microbiota. Surveillance microbiology, decolonization, and augmented hygiene might prevent dissemination of invasive bacteria between and within premature infants.

Validated biomarkers could catalyze environmental enteric dysfunction (EED) research.