Glycosylation is a ubiquitous reaction controlling the bioactivity and storage of plant natural products. Glycosylation of small molecules is catalyzed by a superfamily of glycosyltransferases (GTs) in most plant species studied to date. We present crystal structures of the UDP flavonoid/triterpene GT UGT71G1 from Medicago truncatula bound to UDP or UDP-glucose. The structures reveal the key residues involved in the recognition of donor substrate and, by comparison with other GT structures, suggest His-22 as the catalytic base and Asp-121 as a key residue that may assist deprotonation of the acceptor by forming an electron transfer chain with the catalytic base. Mutagenesis confirmed the roles of these key residues in donor substrate binding and enzyme activity. Our results provide an initial structural basis for understanding the complex substrate specificity and regiospecificity underlying the glycosylation of plant natural products and other small molecules. This information will direct future attempts to engineer bioactive compounds in crop plants to improve plant, animal, and human health and to facilitate the rational design of GTs to improve the storage and stability of novel engineered bioactive compounds.

• The major obstacle for bioenergy production from switchgrass biomass is the low saccharification efficiency caused by cell wall recalcitrance. Saccharification efficiency is negatively correlated with both lignin content and cell wall ester-linked p-coumarate: ferulate (p-CA : FA) ratio. In this study, we cloned and functionally characterized an R2R3-MYB transcription factor from switchgrass and evaluated its potential for developing lignocellulosic feedstocks. • The switchgrass PvMYB4 cDNAs were cloned and expressed in Escherichia coli, yeast, tobacco and switchgrass for functional characterization. Analyses included determination of phylogenetic relations, in situ hybridization, electrophoretic mobility shift assays to determine binding sites in target promoters, and protoplast transactivation assays to demonstrate domains active on target promoters. • PvMYB4 binds to the AC-I, AC-II and AC-III elements of monolignol pathway genes and down-regulates these genes in vivo. Ectopic overexpression of PvMYB4 in transgenic switchgrass resulted in reduced lignin content and ester-linked p-CA : FA ratio, reduced plant stature, increased tillering and an approx. threefold increase in sugar release efficiency from cell wall residues. • We describe an alternative strategy for reducing recalcitrance in switchgrass by manipulating the expression of a key transcription factor instead of a lignin biosynthetic gene. PvMYB4-OX transgenic switchgrass lines can be used as potential germplasm for improvement of lignocellulosic feedstocks and provide a platform for further understanding gene regulatory networks underlying switchgrass cell wall recalcitrance.

Abstract The majority of flavonoids, such as anthocyanins, proanthocyanidins, and isoflavones, are stored in the central vacuole, but the molecular basis of flavonoid transport is still poorly understood. Here, we report the functional characterization of a multidrug and toxin extrusion transporter (MATE2), from Medicago truncatula. MATE 2 is expressed primarily in leaves and flowers. Despite its high similarity to the epicatechin 3′-O-glucoside transporter MATE1, MATE2 cannot efficiently transport proanthocyanidin precursors. In contrast, MATE2 shows higher transport capacity for anthocyanins and lower efficiency for other flavonoid glycosides. Three malonyltransferases that are coexpressed with MATE2 were identified. The malonylated flavonoid glucosides generated by these malonyltransferases are more efficiently taken up into MATE2-containing membrane vesicles than are the parent glycosides. Malonylation increases both the affinity and transport efficiency of flavonoid glucosides for uptake by MATE2. Genetic loss of MATE2 function leads to the disappearance of leaf anthocyanin pigmentation and pale flower color as a result of drastic decreases in the levels of various flavonoids. However, some flavonoid glycoside malonates accumulate to higher levels in MATE2 knockouts than in wild-type controls. Deletion of MATE2 increases seed proanthocyanidin biosynthesis, presumably via redirection of metabolic flux from anthocyanin storage.

Abstract Introduction Transcription factors (TFs) and cis-regulatory elements (CREs) control gene transcripts involved in various biological processes. We hypothesize that TFs and CREs can be effective molecular tools for De Novo regulation designs to engineer plants. Objectives We selected two Arabidopsis TF types and two tobacco CRE types to design a De Novo regulation and evaluated its effectiveness in plant engineering. Methods G-box and MYB recognition elements (MREs) were identified in four Nicotiana tabacum JAZs ( NtJAZs ) promoters. MRE-like and G-box like elements were identified in one nicotine pathway gene promoter. TF screening led to select Arabidopsis Production of Anthocyanin Pigment 1 (PAP1/MYB) and Transparent Testa 8 (TT8/bHLH). Two NtJAZ and two nicotine pathway gene promoters were cloned from commercial Narrow Leaf Madole (NL) and KY171 (KY) tobacco cultivars. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA), cross-linked chromatin immunoprecipitation (ChIP), and dual luciferase assays were performed to test the promoter binding and activation by PAP1 (P), TT8 (T), PAP1/TT8 together, and the PAP1/TT8/Transparent Testa Glabra 1 (TTG1) complex. A DNA cassette was designed and then synthesized for stacking and expressing PAP1 and TT8 together. Three years of field trials were performed by following industrial and GMO protocols. Gene expression and metabolic profiling were completed to characterize plant secondary metabolism. Results PAP1, TT8, PAP1/TT8, and the PAP1/TT8/TTG1 complex bound to and activated NtJAZ promoters but did not bind to nicotine pathway gene promoters. The engineered red P+T plants significantly upregulated four NtJAZs but downregulated the tobacco alkaloid biosynthesis. Field trials showed significant reduction of five tobacco alkaloids and four carcinogenic tobacco specific nitrosamines in most or all cured leaves of engineered P+T and PAP1 genotypes. Conclusion G-boxes, MREs, and two TF types are appropriate molecular tools for a De Novo regulation design to create a novel distant-pathway cross regulation for altering plant secondary metabolism.