Here we describe a glycan microarray constructed by using standard robotic microarray printing technology to couple amine functionalized glycans to an amino-reactive glass slide. The array comprises 200 synthetic and natural glycan sequences representing major glycan structures of glycoproteins and glycolipids. The array has remarkable utility for profiling the specificity of a diverse range of glycan binding proteins, including C-type lectins, siglecs, galectins, anticarbohydrate antibodies, lectins from plants and microbes, and intact viruses.

The hemagglutinin (HA) structure at 2.9 angstrom resolution, from a highly pathogenic Vietnamese H5N1 influenza virus, is more related to the 1918 and other human H1 HAs than to a 1997 duck H5 HA. Glycan microarray analysis of this Viet04 HA reveals an avian alpha2-3 sialic acid receptor binding preference. Introduction of mutations that can convert H1 serotype HAs to human alpha2-6 receptor specificity only enhanced or reduced affinity for avian-type receptors. However, mutations that can convert avian H2 and H3 HAs to human receptor specificity, when inserted onto the Viet04 H5 HA framework, permitted binding to a natural human alpha2-6 glycan, which suggests a path for this H5N1 virus to gain a foothold in the human population.

Influenza A virus specificity for the host is mediated by the viral surface glycoprotein hemagglutinin (HA), which binds to receptors containing glycans with terminal sialic acids. Avian viruses preferentially bind to α2-3-linked sialic acids on receptors of intestinal epithelial cells, whereas human viruses are specific for the α2-6 linkage on epithelial cells of the lungs and upper respiratory tract. To define the receptor preferences of a number of human and avian H1 and H3 viruses, including the 1918 H1N1 pandemic strains, their hemagglutinins were analyzed using a recently described glycan array. The array, which contains 200 carbohydrates and glycoproteins, not only revealed clear differentiation of receptor preferences for α2-3 and/or α2-6 sialic acid linkage, but could also detect fine differences in HA specificity, such as preferences for fucosylation, sulfation and sialylation at positions 2 (Gal) and 3 (GlcNAc, GalNAc) of the terminal trisaccharide. For the two 1918 HA variants, the South Carolina (SC) HA (with Asp190, Asp225) bound exclusively α2-6 receptors, while the New York (NY) variant, which differed only by one residue (Gly225), had mixed α2-6/α2-3 specificity, especially for sulfated oligosaccharides. Only one mutation of the NY variant (Asp190Glu) was sufficient to revert the HA receptor preference to that of classical avian strains. Thus, the species barrier, as defined by the receptor specificity preferences of 1918 human viruses compared to likely avian virus progenitors, can be circumvented by changes at only two positions in the HA receptor binding site. The glycan array thus provides highly detailed profiles of influenza receptor specificity that can be used to map the evolution of new human pathogenic strains, such as the H5N1 avian influenza.

1,3-Dipolar cycloadditions between azides and alkynes were exploited to attach oligosaccharides to a C14 hydrocarbon chain that noncovalently binds to the microtiter well surface. Synthesis of sugar arrays was performed on a micromolar scale in situ in the microtiter plate. As a model study, the β-galactosyllipid 5 was displayed on a 4-μmol scale. Formation of product was confirmed via ESI−MS, and the yield was determined via chemical and biological assays. Several complex carbohydrates (6−16) were also displayed in microtiter plates and successfully screened with various lectins. Moreover, sialyl Lewis x (17) was synthesized via the enzymatic fucosylation of a precursor displayed in the plate. Studies on inhibition of this biotransformation have been carried out, and the IC50 value found for the known inhibitor 20 was consistent with previous studies in solution.

Human galectins have functionally divergent roles, although most of the members of the galectin family bind weakly to the simple disaccharide lactose (Galβ1-4Glc). To assess the specificity of galectin-glycan interactions in more detail, we explored the binding of several important galectins (Gal-1, Gal-2, and Gal-3) using a dose-response approach toward a glycan microarray containing hundreds of structurally diverse glycans, and we compared these results to binding determinants on cells. All three galectins exhibited differences in glycan binding characteristics. On both the microarray and on cells, Gal-2 and Gal-3 exhibited higher binding than Gal-1 to fucose-containing A and B blood group antigens. Gal-2 exhibited significantly reduced binding to all sialylated glycans, whereas Gal-1 bound α2-3- but not α2-6-sialylated glycans, and Gal-3 bound to some glycans terminating in either α2-3- or α2-6-sialic acid. The effects of sialylation on Gal-1, Gal-2, and Gal-3 binding to cells also reflected differences in cellular sensitivity to Gal-1-, Gal-2-, and Gal-3-induced phosphatidylserine exposure. Each galectin exhibited higher binding for glycans with poly-N-acetyllactosamine (poly(LacNAc)) sequences (Galβ1-4GlcNAc)n when compared with N-acetyllactosamine (LacNAc) glycans (Galβ1-4GlcNAc). However, only Gal-3 bound internal LacNAc within poly(LacNAc). These results demonstrate that each of these galectins mechanistically differ in their binding to glycans on the microarrays and that these differences are reflected in the determinants required for cell binding and signaling. The specific glycan recognition by each galectin underscores the basis for differences in their biological activities. Human galectins have functionally divergent roles, although most of the members of the galectin family bind weakly to the simple disaccharide lactose (Galβ1-4Glc). To assess the specificity of galectin-glycan interactions in more detail, we explored the binding of several important galectins (Gal-1, Gal-2, and Gal-3) using a dose-response approach toward a glycan microarray containing hundreds of structurally diverse glycans, and we compared these results to binding determinants on cells. All three galectins exhibited differences in glycan binding characteristics. On both the microarray and on cells, Gal-2 and Gal-3 exhibited higher binding than Gal-1 to fucose-containing A and B blood group antigens. Gal-2 exhibited significantly reduced binding to all sialylated glycans, whereas Gal-1 bound α2-3- but not α2-6-sialylated glycans, and Gal-3 bound to some glycans terminating in either α2-3- or α2-6-sialic acid. The effects of sialylation on Gal-1, Gal-2, and Gal-3 binding to cells also reflected differences in cellular sensitivity to Gal-1-, Gal-2-, and Gal-3-induced phosphatidylserine exposure. Each galectin exhibited higher binding for glycans with poly-N-acetyllactosamine (poly(LacNAc)) sequences (Galβ1-4GlcNAc)n when compared with N-acetyllactosamine (LacNAc) glycans (Galβ1-4GlcNAc). However, only Gal-3 bound internal LacNAc within poly(LacNAc). These results demonstrate that each of these galectins mechanistically differ in their binding to glycans on the microarrays and that these differences are reflected in the determinants required for cell binding and signaling. The specific glycan recognition by each galectin underscores the basis for differences in their biological activities. The galectin family of β-galactoside-binding proteins has over a dozen human members, and each galectin may have different biological roles and recognize different glycan receptors (1Camby I. Le Mercier M. Lefranc F. Kiss R. Glycobiology. 2006; 16: R137-R157Crossref PubMed Scopus (678) Google Scholar, 2Dumic J. Dabelic S. Flogel M. Biochim. Biophys. Acta. 2006; 1760: 616-635Crossref PubMed Scopus (828) Google Scholar, 3Leffler H. Carlsson S. Hedlund M. Qian Y. Poirier F. Glycoconj. J. 2004; 19: 433-440Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 4Ilarregui J.M. Bianco G.A. Toscano M.A. Rabinovich G.A. Ann. Rheum. Dis. 2005; 64 (iv): 96-103Google Scholar). These conclusions are supported by recent studies on the first three vertebrate galectins identified, termed galectin (Gal) 2The abbreviations used are:Galhuman galectinβMEβ-mercaptoethanolLacNAcN-acetyllactosamine (Galβ1GlcNAc)poly(LacNAc)poly-N-acetyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc)nSPRsurface plasmon resonanceCRDcarbohydrate recognition domainGBPglycan-binding proteinPBSphosphate-buffered salinePSphosphatidylserineFITCfluorescein isothiocyanateCHOChinese hamster ovaryLEAL. esculentum agglutininRCA-IR. communis agglutinin-INGN-glycan.2The abbreviations used are:Galhuman galectinβMEβ-mercaptoethanolLacNAcN-acetyllactosamine (Galβ1GlcNAc)poly(LacNAc)poly-N-acetyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc)nSPRsurface plasmon resonanceCRDcarbohydrate recognition domainGBPglycan-binding proteinPBSphosphate-buffered salinePSphosphatidylserineFITCfluorescein isothiocyanateCHOChinese hamster ovaryLEAL. esculentum agglutininRCA-IR. communis agglutinin-INGN-glycan.-1, Gal-2, and Gal-3. Gal-1 inhibits mast cell degranulation (5Rubinstein N. Ilarregui J.M. Toscano M.A. Rabinovich G.A. Tissue Antigens. 2004; 64: 1-12Crossref PubMed Scopus (159) Google Scholar), whereas Gal-3 induces degranulation in mast cells independently of IgE-mediated antigen stimulation (6Frigeri L.G. Zuberi R.I. Liu F.T. Biochemistry. 1993; 32: 7644-7649Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar). Gal-1 blocks leukocyte chemotaxis (7La M. Cao T.V. Cerchiaro G. Chilton K. Hirabayashi J. Kasai K. Oliani S.M. Chernajovsky Y. Perretti M. Am. J. Pathol. 2003; 163: 1505-1515Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (131) Google Scholar), whereas Gal-3 has the opposite effect, inducing leukocyte chemotaxis (8Sano H. Hsu D.K. Yu L. Apgar J.R. Kuwabara I. Yamanaka T. Hirashima M. Liu F.T. J. Immunol. 2000; 165: 2156-2164Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar) and the release of pre-formed interleukin-8 from neutrophils (9Jeng K.C. Frigeri L.G. Liu F.T. Immunol. Lett. 1994; 42: 113-116Crossref PubMed Scopus (106) Google Scholar), which further augments chemotaxis of leukocytes (10Baggiolini M. Clark-Lewis I. FEBS Lett. 1992; 307: 97-101Crossref PubMed Scopus (725) Google Scholar). In addition, whereas Gal-1 inhibits acute inflammatory responses through various mechanisms, including suppression of phospholipase A2-induced edema (11Rabinovich G.A. Sotomayor C.E. Riera C.M. Bianco I. Correa S.G. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 1331-1339Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar) and inhibition of neutrophil extravasation (7La M. Cao T.V. Cerchiaro G. Chilton K. Hirabayashi J. Kasai K. Oliani S.M. Chernajovsky Y. Perretti M. Am. J. Pathol. 2003; 163: 1505-1515Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (131) Google Scholar), Gal-3 enhances the extravasation of neutrophils, and Gal-3 null mice also exhibit attenuated leukocyte infiltration following challenge (12Hsu D.K. Yang R.Y. Pan Z. Yu L. Salomon D.R. Fung-Leung W.P. Liu F.T. Am. J. Pathol. 2000; 156: 1073-1083Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (380) Google Scholar). Interestingly, patients with reduced Gal-2 expression were found to have reduced risk for myocardial infarction, suggesting that Gal-2 may also have pro-inflammatory roles (13Ozaki K. Inoue K. Sato H. Iida A. Ohnishi Y. Sekine A. Sato H. Odashiro K. Nobuyoshi M. Hori M. Nakamura Y. Tanaka T. Nature. 2004; 429: 72-75Crossref PubMed Scopus (213) Google Scholar). Furthermore, Gal-1, Gal-2, and Gal-3 have all been reported to signal T cells through different receptors (14Hahn H.P. Pang M. He J. Hernandez J.D. Yang R.Y. Li L.Y. Wang X. Liu F.T. Baum L.G. Cell Death Differ. 2004; 11: 1277-1286Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar, 15Sturm A. Lensch M. Andre S. Kaltner H. Wiedenmann B. Rosewicz S. Dignass A.U. Gabius H.J. J. Immunol. 2004; 173: 3825-3837Crossref PubMed Scopus (184) Google Scholar, 16Stillman B.N. Hsu D.K. Pang M. Brewer C.F. Johnson P. Liu F.T. Baum L.G. J. Immunol. 2006; 176: 778-789Crossref PubMed Scopus (383) Google Scholar). These types of studies suggest that Gal-1, Gal-2, and Gal-3 recognize distinct receptors on leukocytes. human galectin β-mercaptoethanol N-acetyllactosamine (Galβ1GlcNAc) poly-N-acetyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc)n surface plasmon resonance carbohydrate recognition domain glycan-binding protein phosphate-buffered saline phosphatidylserine fluorescein isothiocyanate Chinese hamster ovary L. esculentum agglutinin R. communis agglutinin-I N-glycan. human galectin β-mercaptoethanol N-acetyllactosamine (Galβ1GlcNAc) poly-N-acetyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc)n surface plasmon resonance carbohydrate recognition domain glycan-binding protein phosphate-buffered saline phosphatidylserine fluorescein isothiocyanate Chinese hamster ovary L. esculentum agglutinin R. communis agglutinin-I N-glycan. There is compelling evidence, however, that different galectins may also recognize related receptors. For example, Gal-3 attenuates Gal-1 inhibition of growth in neuroblastoma cells at the receptor level, and both Gal-1 and Gal-3 induce superoxide production in human neutrophils (17Almkvist J. Dahlgren C. Leffler H. Karlsson A. J. Immunol. 2002; 168: 4034-4041Crossref PubMed Scopus (77) Google Scholar, 18Almkvist J. Faldt J. Dahlgren C. Leffler H. Karlsson A. Infect. Immun. 2001; 69: 832-837Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar, 19Yamaoka A. Kuwabara I. Frigeri L.G. Liu F.T. J. Immunol. 1995; 154: 3479-3487PubMed Google Scholar). Gal-1 and Gal-2 both induce surface exposure of phosphatidylserine (PS) in activated human neutrophils in the absence of apoptosis through a Ca2+-dependent pathway (20Karmakar S. Cummings R.D. McEver R.P. J. Biol. Chem. 2005; 280: 28623-28631Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (30) Google Scholar). Therefore, although Gal-1, Gal-2, and Gal-3 may recognize discrete glycoconjugates, they may also recognize some common receptors. In this way, galectins likely exhibit unique versatility in a wide range of biological functions (3Leffler H. Carlsson S. Hedlund M. Qian Y. Poirier F. Glycoconj. J. 2004; 19: 433-440Crossref PubMed Scopus (515) Google Scholar, 4Ilarregui J.M. Bianco G.A. Toscano M.A. Rabinovich G.A. Ann. Rheum. Dis. 2005; 64 (iv): 96-103Google Scholar). Although some differences have been reported in glycan recognition by these galectins (21Hirabayashi J. Hashidate T. Arata Y. Nishi N. Nakamura T. Hirashima M. Urashima T. Oka T. Futai M. Muller W.E. Yagi F. Kasai K. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1572: 232-254Crossref PubMed Scopus (817) Google Scholar, 22Brewer C.F. Glycoconj. J. 2004; 19: 459-465Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar, 23Sato S. Hughes R.C. J. Biol. Chem. 1992; 267: 6983-6990Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Solomon J.C. Stoll M.S. Penfold P. Abbott W.M. Childs R.A. Hanfland P. Feizi T. Carbohydr. Res. 1991; 213: 293-307Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar, 25Sparrow C.P. Leffler H. Barondes S.H. J. Biol. Chem. 1987; 262: 7383-7390Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 26Leffler H. Barondes S.H. J. Biol. Chem. 1986; 261: 10119-10126Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 27Knibbs R.N. Agrwal N. Wang J.L. Goldstein I.J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 14940-14947Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 28Feizi T. Solomon J.C. Yuen C.T. Jeng K.C. Frigeri L.G. Hsu D.K. Liu F.T. Biochemistry. 1994; 33: 6342-6349Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar), there are many questions remaining about their glycan recognition and subsequent effects on galectin binding. It has been suggested that differences in the biological effects of Gal-1 and Gal-3 result from differences in tertiary structure, rather than ligand binding properties (29Perillo N.L. Pace K.E. Seilhamer J.J. Baum L.G. Nature. 1995; 378: 736-739Crossref PubMed Scopus (940) Google Scholar, 30Ahmad N. Gabius H.J. Andre S. Kaltner H. Sabesan S. Roy R. Liu B. Macaluso F. Brewer C.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 10841-10847Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (426) Google Scholar), because Gal-3 was thought to behave primarily as a monomer (31Massa S.M. Cooper D.N. Leffler H. Barondes S.H. Biochemistry. 1993; 32: 260-267Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar). Tertiary structure differences may contribute to differences in cellular responses to different galectins (30Ahmad N. Gabius H.J. Andre S. Kaltner H. Sabesan S. Roy R. Liu B. Macaluso F. Brewer C.F. J. Biol. Chem. 2004; 279: 10841-10847Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (426) Google Scholar, 32Nieminen J. Kuno A. Hirabayashi J. Sato S. J. Biol. Chem. 2007; 282: 1374-1383Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (184) Google Scholar); however, Gal-3 can form homo-oligomeric structures (32Nieminen J. Kuno A. Hirabayashi J. Sato S. J. Biol. Chem. 2007; 282: 1374-1383Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (184) Google Scholar), which supports the likelihood that the major differences in biological functions by these lectins are because of differences in glycan recognition. Previous studies on glycan recognition by galectins and most other glycan-binding proteins (GBPs) have been limited because of the availability and diversity of glycans tested (22Brewer C.F. Glycoconj. J. 2004; 19: 459-465Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). This limitation arises from the difficulty of synthesizing a large diverse library of glycan structures (33Blixt O. Head S. Mondala T. Scanlan C. Huflejt M.E. Alvarez R. Bryan M.C. Fazio F. Calarese D. Stevens J. Razi N. Stevens D.J. Skehel J.J. van Die I. Burton D.R. Wilson I.A. Cummings R. Bovin N. Wong C.H. Paulson J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 17033-17038Crossref PubMed Scopus (961) Google Scholar). In addition, the methods of analysis may have also hindered the identification of differential specificity. For example, we recently found that the specificity of Gal-1 for glycans depends not only on the structure of glycans but also the mode of their presentation (34Leppanen A. Stowell S. Blixt O. Cummings R.D. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5549-5562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar), either in solid phase or in solution. In equilibrium gel filtration assays, similar to other solution-based assays (21Hirabayashi J. Hashidate T. Arata Y. Nishi N. Nakamura T. Hirashima M. Urashima T. Oka T. Futai M. Muller W.E. Yagi F. Kasai K. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1572: 232-254Crossref PubMed Scopus (817) Google Scholar, 22Brewer C.F. Glycoconj. J. 2004; 19: 459-465Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar), Gal-1 binds glycans with a single N-acetyllactosamine (LacNAc) unit (Galβ1-4GlcNAc) equivalently to those with poly-N-acetyllactosamine (poly(LacNAc)) sequences (Galβ1-4GlcNAc)n; however, the dimeric form of Gal-1 showed a significant preference for the poly(LacNAc)-containing glycans in solid phase assays (34Leppanen A. Stowell S. Blixt O. Cummings R.D. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5549-5562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar, 35Stowell S.R. Dias-Baruffi M. Penttila L. Renkonen O. Nyame A.K. Cummings R.D. Glycobiology. 2004; 14: 157-167Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar). Significantly, Gal-1 failed to recognize internal Lac-NAc units within poly(LacNAc) (34Leppanen A. Stowell S. Blixt O. Cummings R.D. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5549-5562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar, 35Stowell S.R. Dias-Baruffi M. Penttila L. Renkonen O. Nyame A.K. Cummings R.D. Glycobiology. 2004; 14: 157-167Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar), suggesting that this preference likely reflects favorable poly(LacNAc) conformational constraints of the terminal LacNAc unit that are enhanced by immobilization (34Leppanen A. Stowell S. Blixt O. Cummings R.D. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5549-5562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar). Gal-1 also recognized poly-(LacNAc)-containing glycans on leukocyte surfaces with a similar affinity as observed for immobilized poly(LacNAc) glycans (34Leppanen A. Stowell S. Blixt O. Cummings R.D. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5549-5562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar), corroborating the reliability of the solid phase binding studies. Similarly, analyses of Gal-1, Gal-2, and Gal-3 utilizing frontal affinity chromatography or isothermal calorimetry, in which the glycans are free in solution, also do not reveal profound differences in carbohydrate recognition (21Hirabayashi J. Hashidate T. Arata Y. Nishi N. Nakamura T. Hirashima M. Urashima T. Oka T. Futai M. Muller W.E. Yagi F. Kasai K. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1572: 232-254Crossref PubMed Scopus (817) Google Scholar, 22Brewer C.F. Glycoconj. J. 2004; 19: 459-465Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar, 36Ahmad N. Gabius H.J. Sabesan S. Oscarson S. Brewer C.F. Glycobiology. 2004; 14: 817-825Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar), further suggesting that galectin-glycan interactions may be most usefully tested in the context of immobilized glycan presentation. However, whether Gal-2 and Gal-3 behave like Gal-1 in showing a different glycan preference when glycans are immobilized has not been studied, nor has the in vitro binding data been correlated to binding determinants on cell surfaces. These issues prompted us to evaluate Gal-1, Gal-2, and Gal-3 interactions using immobilized glycans in a glycan microarray format that includes several hundred structurally diverse glycans (33Blixt O. Head S. Mondala T. Scanlan C. Huflejt M.E. Alvarez R. Bryan M.C. Fazio F. Calarese D. Stevens J. Razi N. Stevens D.J. Skehel J.J. van Die I. Burton D.R. Wilson I.A. Cummings R. Bovin N. Wong C.H. Paulson J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 17033-17038Crossref PubMed Scopus (961) Google Scholar, 34Leppanen A. Stowell S. Blixt O. Cummings R.D. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5549-5562Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (135) Google Scholar, 37Bochner B.S. Alvarez R.A. Mehta P. Bovin N.V. Blixt O. White J.R. Schnaar R.L. J. Biol. Chem. 2005; 280: 4307-4312Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (222) Google Scholar), along with parallel studies of binding to a variety of human cells. To more accurately determine the binding specificity of Gal-1, Gal-2, and Gal-3 using the glycan microarray format, we evaluated binding of each galectin over a broad concentration range. This allowed us to extrapolate a binding isotherm for each galectin toward each respective glycan. To determine whether the specificity obtained using this method reflected similar binding patterns toward cells, we tested the binding toward promyelocytic HL60 cells, which respond to signals by these galectins resulting in exposure of surface PS (38Stowell S.R. Karmakar S. Stowell C.J. Dias-Baruffi M. McEver R.P. Cummings R.D. Blood. 2007; 109: 219-227Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar, 39Fukumori T. Takenaka Y. Yoshii T. Kim H.R. Hogan V. Inohara H. Kagawa S. Raz A. Cancer Res. 2003; 63: 8302-8311PubMed Google Scholar), and tested binding to human erythrocytes. Our results provide novel insights into differential glycan recognition by each of these galectins and provide support for using glycan microarrays in conjunction with cell binding studies to explore glycan recognition by glycan-binding proteins (33Blixt O. Head S. Mondala T. Scanlan C. Huflejt M.E. Alvarez R. Bryan M.C. Fazio F. Calarese D. Stevens J. Razi N. Stevens D.J. Skehel J.J. van Die I. Burton D.R. Wilson I.A. Cummings R. Bovin N. Wong C.H. Paulson J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 17033-17038Crossref PubMed Scopus (961) Google Scholar). Preparation of Human Gal-1, Gal-2, and Gal-3—Human galectins were prepared as outlined previously (35Stowell S.R. Dias-Baruffi M. Penttila L. Renkonen O. Nyame A.K. Cummings R.D. Glycobiology. 2004; 14: 157-167Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar, 40Dias-Baruffi M. Zhu H. Cho M. Karmakar S. McEver R.P. Cummings R.D. J. Biol. Chem. 2003; 278: 41282-41293Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (146) Google Scholar). Each recombinant galectin was purified by affinity chromatography on lactosyl-Sepharose, and bound lectin was eluted with 100 mm lactose in PBS, 14 mm βME. Prior to derivatization, βME was removed from galectin samples by utilizing a PD-10 gel filtration column (GE Healthcare), followed by the addition of lactose (100 mm final concentration) to help maintain the stability of each galectin and reduce the likelihood of adduct formation at or near the carbohydrate recognition domain. Alexa Fluor 488-labeled forms of galectins were prepared using either Alexa Fluor 488 C5-maleimide or Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester, dilithium salt-reactive dyes (Molecular Probes) as described (35Stowell S.R. Dias-Baruffi M. Penttila L. Renkonen O. Nyame A.K. Cummings R.D. Glycobiology. 2004; 14: 157-167Crossref PubMed Scopus (103) Google Scholar). We found that derivatization of Gal-2 with Alexa dyes substantially decreased the stability of the protein; thus, all studies assessing Gal-2 glycan recognition utilized biotinylated Gal-2. Galectins were biotinylated by incubating 3-5 mg/ml of each galectin with 2 mm EZ-link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin (sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate) (Pierce) for 2 h at 4 °C. Unconjugated EZ-link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin and free lactose were separated from galectin using a PD-10 gel filtration column. Galectins were re-chromatographed over lactosyl-Sepharose to remove any inactive material following labeling. Bound galectin was eluted with 100 mm lactose, then applied to a PD-10 gel filtration column to remove lactose, and stored at 4 °C in 14 mm βME in PBS until further use. Control lectins, peanut agglutinin (Arachis hypogaea) (200 μg/ml), Ricinus communis agglutinin I (RCA-I) (2 μg/ml), Sambucus nigra agglutinin (200 μg/ml), and Lycopersicon esculentum agglutinin (LEA) (200 μg/ml) were purchased from Vector Laboratories and utilized under the same assay conditions as Gal-1, Gal-2, and Gal-3. Cholera toxin subunit B (Molecular Probes) was also assayed under the same conditions at 200 μg/ml. Binding of Galectin to Aminoalkyl Glycosides Immobilized on Activated (N-Hydroxysuccinimidyl) Glass Surface—Glycan microarrays were prepared as described previously (33Blixt O. Head S. Mondala T. Scanlan C. Huflejt M.E. Alvarez R. Bryan M.C. Fazio F. Calarese D. Stevens J. Razi N. Stevens D.J. Skehel J.J. van Die I. Burton D.R. Wilson I.A. Cummings R. Bovin N. Wong C.H. Paulson J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 17033-17038Crossref PubMed Scopus (961) Google Scholar, 37Bochner B.S. Alvarez R.A. Mehta P. Bovin N.V. Blixt O. White J.R. Schnaar R.L. J. Biol. Chem. 2005; 280: 4307-4312Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (222) Google Scholar) and obtained from the National Institutes of Health/NIGMS-funded Consortium for Functional Glycomics. For galectin recognition of glycans on the printed glycan microarray, a solution of between 0.1 and 10 μm galectin in PBS containing 0.005% Tween 20 and 14 mm βME was incubated for 1 h at 25 °C. The slide was then immersed in PBS containing 0.005% Tween 20, drained, and then overlaid with FITC-streptavidin. After 1 h at room temperature in a dark humid chamber, the slide was washed by successive immersion in PBS, 0.01% Tween 20 (three times) and water, 0.1% Tween 20 (twice). The slide was briefly rinsed with distilled water and dried under microfiltered air. An image of bound fluorescence was obtained using a microarray scanner (Scan Array Express, PerkinElmer Life Sciences). The integrated spot intensities were determined using Metamorph software (Universal Imaging, Downingtown, PA). Measurement of Galectin Binding Affinity Using Surface Plasmon Resonance (SPR)—All surface plasmon resonance (SPR) experiments were performed at 25 °C on a Biacore 3000 instrument (Biacore AB (part of GE Healthcare)) largely as outlined previously (33Blixt O. Head S. Mondala T. Scanlan C. Huflejt M.E. Alvarez R. Bryan M.C. Fazio F. Calarese D. Stevens J. Razi N. Stevens D.J. Skehel J.J. van Die I. Burton D.R. Wilson I.A. Cummings R. Bovin N. Wong C.H. Paulson J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 17033-17038Crossref PubMed Scopus (961) Google Scholar, 37Bochner B.S. Alvarez R.A. Mehta P. Bovin N.V. Blixt O. White J.R. Schnaar R.L. J. Biol. Chem. 2005; 280: 4307-4312Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (222) Google Scholar, 41van Liempt E. Bank C.M. Mehta P. Garcia-Vallejo J.J. Kawar Z.S. Geyer R. Alvarez R.A. Cummings R.D. Kooyk Y. van Die I. FEBS Lett. 2006; 580: 6123-6131Crossref PubMed Scopus (207) Google Scholar, 42Nam H.J. Gurda-Whitaker B. Yee Gan W. Ilaria S. McKenna R. Mehta P. Alvarez R.A. Agbandje-McKenna M. J. Biol. Chem. 2006; 281: 25670-25677Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (54) Google Scholar). Biotinylated glycosides were captured on research grade streptavidin-coated sensor chips (Sensor Chip SA, Biacore Inc.) that were pretreated according to the manufacturer's instructions. A solution of each biotinylated glycoside (10 fmol/ml) was injected at 2 ml/min in PBS, pH 7, containing 0.005% Tween 20 (running buffer) for varying lengths of time (3-7 min) until an optimal amount of glycan was captured on each independent surface. Three related glycosides were studied using one streptavidin sensor chip. A control (nonbinding) glycan, arabinose, was also captured on the same sensor chip, and the specific binding of nonderivatized recombinant Gal-1, Gal-2, or Gal-3 for the test glycans was measured using the in-line reference subtraction feature of the Biacore 3000 instrument. Increasing concentrations of Gal-1, Gal-2, or Gal-3 (0.1-100 μm) were injected at a flow rate of 60 ml/min over all four surfaces of the sensor chip. Bound Gal-1, Gal-2, or Gal-3 were eluted with the running buffer after the injection was complete. The equilibrium binding data of Gal-1, Gal-2, or Gal-3 were analyzed by nonlinear curve fitting using the BIAevaluation software (Biacore Inc.). Cell Culture—Promyelocytic leukemia HL60 cells were obtained from ATCC and maintained at 37 °C and 5% CO2 in complete RPMI medium (RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, 2 mm glutamine, 100 milliunits/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin). Chinese hamster ovary (CHO) cells were maintained in complete Dulbecco's modified Eagle's medium (Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% FBS, 2 mm glutamine, 100 milliunits/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin) at 37 °C and 5% CO2. Enzymatic Deglycosylation—Prior to enzymatic deglycosylation, HL60 cells were fixed by washing three times in PBS at 4 °C, followed by resuspension in 2% paraformaldehyde buffered in PBS, pH 7.4, at 4 °C. Cells were allowed to fix overnight on a shaker at 4 °C. Following fixation, cells were washed three times in PBS and then two times in the appropriate buffer as recommended by the manufacturer. For enzymatic digestion of cell surface glycans, fixed cells were washed in the following buffers. Cells were washed in 50 mm sodium citrate, pH 6.0, and incubated with 250 milliunits of Salmonella typhimurium α2-3-neuraminidase (New England Biolabs) at 107 cells/ml for 12 h at 37 °C. Cells were washed in 50 mm sodium citrate with 100 mm sodium chloride, pH 6.0, and incubated with 250 milliunits of Clostridium perfringens α2-3-α2-6-neuraminidase (New England Biolabs) at 107 cells/ml for 12 h at 37 °C. Cells were washed in 50 mm sodium acetate, pH 5.8, and incubated with 200 milliunits of Escherichia freundii endo-β-galactosidase (Seikagaku Kogyo) at 107 cells/ml for 24 h at 37 °C. Cells were washed with 50 mm sodium phosphate, pH 5.8, and incubated with 200 milliunits of Bacteroides fragilis endo-β-galactosidase (Calbiochem; QA Labs) at 107 cells/ml for 24 h at 37 °C. Cells were washed in 50 mm sodium phosphate, pH 5.0, and incubated with 100 milliunits jack bean β-galactosidase (Glyko) at 107 cells/ml for 12 h. Buffer control treatments lacking enzymes were used for each individual condition. Galectin Binding to Cells—For lectin binding, cells were washed twice in PBS at 4 °C and incubated with biotinylated Gal-1, Gal-2, Gal-3, or the indicated plant lectins (LEA, RCA-I, and Maackia amurensis lectin II; Vector Laboratories) at a concentration of between 5 and 10 μg/ml at 4 °C for 1 h. As controls, cells were incubated with 50 mm lactose along with the galectins. Cells were washed three times and then incubated with Alexa Fluor 488 streptavidin or Alexa Fluor 633 streptavidin (Molecular Probes) at 4 °C for 1 h. Cells were then washed twice, followed by resuspension in 400 μl of PBS for analysis by flow cytometry using a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences). The bars in each graph represent the % change in binding when compared with the binding of control buffer treated cells from each enzymatic pair. Error bars in each graph represent standard deviation of duplicate analysis. Measuring Galectin-induced PS Exposure—For annexin-V staining, cells were treated for 1 h with 100 milliunits of Arthrobacter ureafaciens neuraminidase or buffer control (RPMI 1640 media or Hanks' balanced salt solution). Cells were washed following treatment in complete RPMI, followed by resuspension in complete RPMI at 106 cells/ml. Cells were treated with 20 μm Gal-1, Gal-2, or Gal-3 or at the concentrations indicated at 37 °C and 5% CO2 for 4 h followed by disengagement with 50 mm lactose and staining with annexin-V (CalTag) as outlined previously (38Stowell S.R. Karmakar S. Stowell C.J. Dias-Baruffi M. McEver R.P. Cummings R.D. Blood. 2007; 109: 219-227Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar). Galectin binding toward cells treated with A. ureafaciens neuraminidase was accomplished as outlined above. Confocal Microscopy—Cells were incubated with FITC-LEA (Vector Laboratories) and either Gal-1-biotin, Gal-2-biotin, or Gal-3-biotin at 4 °C for 1 h. Cells were washed and incubated wit