The identification of mutations in the SRY-related SOX9 gene in patients with campomelic dysplasia, a severe skeletal malformation syndrome, and the abundant expression of Sox9 in mouse chondroprogenitor cells and fully differentiated chondrocytes during embryonic development have suggested the hypothesis that SOX9 might play a role in chondrogenesis. Our previous experiments with the gene (Col2a1) for collagen II, an early and abundant marker of chondrocyte differentiation, identified a minimal DNA element in intron 1 which directs chondrocyte-specific expression in transgenic mice. This element is also a strong chondrocyte-specific enhancer in transient transfection experiments. We show here that Col2a1 expression is closely correlated with high levels of SOX9 RNA and protein in chondrocytes. Our experiments indicate that the minimal Col2a1 enhancer is a direct target for Sox9. Indeed, SOX9 binds to a sequence of the minimal Col2a1 enhancer that is essential for activity in chondrocytes, and SOX9 acts as a potent activator of this enhancer in cotransfection experiments in nonchondrocytic cells. Mutations in the enhancer that prevent binding of SOX9 abolish enhancer activity in chondrocytes and suppress enhancer activation by SOX9 in nonchondrocytic cells. Other SOX family members are ineffective. Expression of a truncated SOX9 protein lacking the transactivation domain but retaining DNA-binding activity interferes with enhancer activation by full-length SOX9 in fibroblasts and inhibits enhancer activity in chondrocytes. Our results strongly suggest a model whereby SOX9 is involved in the control of the cell-specific activation of COL2A1 in chondrocytes, an essential component of the differentiation program of these cells. We speculate that in campomelic dysplasia a decrease in SOX9 activity would inhibit production of collagen II, and eventually other cartilage matrix proteins, leading to major skeletal anomalies.

To assess the role of the transcription factor Sox9 in cartilage formation we have compared the expression pattern of Sox9 and Col2a1 at various stages of mouse embryonic development. Expression of Col2a1 colocalized with expression of Sox9 in all chondroprogenitor cells. In the sclerotomal compartment of somites the onset of Sox9 expression preceded that of Col2a1. A perfect correlation was also seen between high levels of Sox9 expression and high levels of Col2a1 expression in chondrocytic cells. However, no Sox9 expression was detected in hypertrophic chondrocytes; only low levels of Col2a1 RNA were found in the upper hypertrophic zone. Coexpression of Sox9 and Col2a1 was also seen in the notochord. At E11.5 Sox9 expression in the brain and spinal neural tube was more widespread than that of Col2a1 although at E14.5 Sox9 and Col2a1 transcripts were colocalized in discrete areas of the brain. Distinct differences between Sox9 and Col2a1 expression were observed in the otic vesicle at E11.5. At E8.5, expression of Sox9 but not of Col2a1 was seen in the dorsal tips of the neural folds and after neural tube closure also in presumptive crest cells emigrating from the dorsal pole of the neural tube. No Col2a1 expression was detected in gonadal ridges in which high levels of Sox9 expression were detected. Together with our previous results showing that the chondrocyte-specific enhancer element of the Col2a1 gene is a direct target for Sox9, these results suggest that Sox9 plays a major role in expression of Col2a1. The correlation between high expression levels of Sox9 and high expression levels of Col2a1 in chondrocytes suggests the hypothesis that high levels of Sox9 are needed for full expression of the chondrocyte phenotype; lower levels of Sox9 such as in neuronal tissues which are also associated with lower expression levels of Col2a1 would be compatible with other cell specifications. Dev. Dyn. 209:377–386, 1997. © 1997 Wiley-Liss, Inc.

The long-term integrity of an articulating joint is dependent upon the nourishment of its cartilage component and the protection of the cartilage surface from friction-induced wear. Loss-of-function mutations in lubricin (a secreted glycoprotein encoded by the gene PRG4) cause the human autosomal recessive disorder camptodactyly-arthropathy-coxa vara-pericarditis syndrome (CACP). A major feature of CACP is precocious joint failure. In order to delineate the mechanism by which lubricin protects joints, we studied the expression of Prg4 mRNA during mouse joint development, and we created lubricin-mutant mice. Prg4 began to be expressed in surface chondrocytes and synoviocytes after joint cavitation had occurred and remained strongly expressed by these cells postnatally. Mice lacking lubricin were viable and fertile. In the newborn period, their joints appeared normal. As the mice aged, we observed abnormal protein deposits on the cartilage surface and disappearance of underlying superficial zone chondrocytes. In addition to cartilage surface changes and subsequent cartilage deterioration, intimal cells in the synovium surrounding the joint space became hyperplastic, which further contributed to joint failure. Purified or recombinant lubricin inhibited the growth of these synoviocytes in vitro. Tendon and tendon sheath involvement was present in the ankle joints, where morphologic changes and abnormal calcification of these structures were observed. We conclude that lubricin has multiple functions in articulating joints and tendons that include the protection of surfaces and the control of synovial cell growth.

The long-term integrity of an articulating joint is dependent upon the nourishment of its cartilage component and the protection of the cartilage surface from friction-induced wear. Loss-of-function mutations in lubricin (a secreted glycoprotein encoded by the gene PRG4) cause the human autosomal recessive disorder camptodactyly-arthropathy-coxa vara-pericarditis syndrome (CACP). A major feature of CACP is precocious joint failure. In order to delineate the mechanism by which lubricin protects joints, we studied the expression of Prg4 mRNA during mouse joint development, and we created lubricin-mutant mice. Prg4 began to be expressed in surface chondrocytes and synoviocytes after joint cavitation had occurred and remained strongly expressed by these cells postnatally. Mice lacking lubricin were viable and fertile. In the newborn period, their joints appeared normal. As the mice aged, we observed abnormal protein deposits on the cartilage surface and disappearance of underlying superficial zone chondrocytes. In addition to cartilage surface changes and subsequent cartilage deterioration, intimal cells in the synovium surrounding the joint space became hyperplastic, which further contributed to joint failure. Purified or recombinant lubricin inhibited the growth of these synoviocytes in vitro. Tendon and tendon sheath involvement was present in the ankle joints, where morphologic changes and abnormal calcification of these structures were observed. We conclude that lubricin has multiple functions in articulating joints and tendons that include the protection of surfaces and the control of synovial cell growth.

The transcription factor Sox9 is necessary for early chondrogenesis, but its subsequent roles in the cartilage growth plate, a highly specialized structure that drives skeletal growth and endochondral ossification, remain unclear. Using a doxycycline-inducible Cre transgene and Sox9 conditional null alleles in the mouse, we show that Sox9 is required to maintain chondrocyte columnar proliferation and generate cell hypertrophy, two key features of functional growth plates. Sox9 keeps Runx2 expression and β-catenin signaling in check and thereby inhibits not only progression from proliferation to prehypertrophy, but also subsequent acquisition of an osteoblastic phenotype. Sox9 protein outlives Sox9 RNA in upper hypertrophic chondrocytes, where it contributes with Mef2c to directly activate the major marker of these cells, Col10a1. These findings thus reveal that Sox9 remains a central determinant of the lineage fate and multistep differentiation program of growth plate chondrocytes and thereby illuminate our understanding of key molecular mechanisms underlying skeletogenesis.

The Sry-related high-mobility-group box transcription factor Sox9 recruits the redundant L-Sox5 and Sox6 proteins to effect chondrogenesis, but the mode of action of the trio remains unclear. We identify here a highly conserved 359-bp sequence 10 kb upstream of the Agc1 gene for aggrecan, a most essential cartilage proteoglycan and key marker of chondrocyte differentiation. This sequence directs expression of a minimal promoter in both embryonic and adult cartilage in transgenic mice, in a manner that matches Agc1 expression. The chondrogenic trio is required and sufficient to mediate the activity of this enhancer. It acts directly, Sox9 binding to a critical cis-acting element and L-Sox5/Sox6 binding to three additional elements, which are cooperatively needed. Upon binding to their specific sites, L-Sox5/Sox6 increases the efficiency of Sox9 binding to its own recognition site and thereby robustly potentiates the ability of Sox9 to activate the enhancer. L-Sox5/Sox6 similarly secures Sox9 binding to Col2a1 (encoding collagen-2) and other cartilage-specific enhancers. This study thus uncovers critical cis-acting elements and transcription factors driving Agc1 expression in cartilage and increases understanding of the mode of action of the chondrogenic Sox trio.

SOX9 is a transcriptional activator required for chondrogenesis, and SOX5 and SOX6 are closely related DNA-binding proteins that critically enhance its function. We use here genome-wide approaches to gain novel insights into the full spectrum of the target genes and modes of action of this chondrogenic trio. Using the RCS cell line as a faithful model for proliferating/early prehypertrophic growth plate chondrocytes, we uncover that SOX6 and SOX9 bind thousands of genomic sites, frequently and most efficiently near each other. SOX9 recognizes pairs of inverted SOX motifs, whereas SOX6 favors pairs of tandem SOX motifs. The SOX proteins primarily target enhancers. While binding to a small fraction of typical enhancers, they bind multiple sites on almost all super-enhancers (SEs) present in RCS cells. These SEs are predominantly linked to cartilage-specific genes. The SOX proteins effectively work together to activate these SEs and are required for in vivo expression of their associated genes. These genes encode key regulatory factors, including the SOX trio proteins, and all essential cartilage extracellular matrix components. Chst11, Fgfr3, Runx2 and Runx3 are among many other newly identified SOX trio targets. SOX9 and SOX5/SOX6 thus cooperate genome-wide, primarily through SEs, to implement the growth plate chondrocyte differentiation program.

SOX9 encodes an SRY-related transcription factor critical for chondrogenesis and sex determination among other processes. Loss-of-function variants cause campomelic dysplasia and Pierre Robin Sequence, while both gain- and loss-of-function variants cause disorders of sex development. SOX9 has also been linked to scoliosis and cancers, but variants are undetermined. It is highly expressed in tooth progenitor cells, but its odontogenic roles remain elusive and tooth defects are unreported in SOX9-related conditions. We here performed whole-exome sequencing for nine unrelated children with tooth eruption delay and no known syndromes, and identified a seven-year-old girl heterozygous for a SOX9 p.Thr239Pro variant and a ten-year-old boy heterozygous for presumably adjacent p.Thr239Pro and p.Thr240Pro variants. These variants were de novo and rare in control populations. Both cases had primary tooth eruption delay. Additionally, the boy had mesiodens blocking permanent central upper incisor eruption, severe scoliosis and mild craniofacial and appendicular skeleton abnormalities. p.Thr239 and p.Thr240 occupy variable and obligatory positions, respectively, in a Cdc4/FBXW7-targeted phosphodegron motif fully conserved in SOX9 vertebrate orthologs and SOX8 and SOX10 paralogs, but functionally uncharacterized in vivo. Structural modeling predicted p.Thr240Pro and p.Thr239Pro/p.Thr240Pro but not p.Thr239Pro to strongly reduce SOX9/FBXW7 interaction. Accordingly, p.Thr240Pro and p.Thr239Pro/p.Thr240Pro but not p.Thr239Pro blocked FBXW7-induced SOX9 degradation in cultured cells. All variants increased SOX9-mediated reporter activation independently of protein stabilization, suggesting that CPD may also modulate SOX9's transactivation function. Altogether, these findings concur that CPD has critical functions, that SOX9 decisively controls odontogenesis, and that gain-of-function variants may markedly perturb both this process and skeletogenesis.

Achondroplasia, the most prevalent short-stature disorder, is caused by missense variants overactivating the fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3). As current surgical and pharmaceutical treatments only partially improve some disease features, we sought to explore a genetic approach. We show that an enhancer located 29 kb upstream of mouse Fgfr3 (-29E) is sufficient to confer a transgenic mouse reporter with a domain of expression in cartilage matching that of Fgfr3. Its CRISPR/Cas9-mediated deletion in otherwise WT mice reduced Fgfr3 expression in this domain by half without causing adverse phenotypes. Importantly, its deletion in mice harboring the ortholog of the most common human achondroplasia variant largely normalized long bone and vertebral body growth, markedly reduced spinal canal and foramen magnum stenosis, and improved craniofacial defects. Consequently, mouse achondroplasia is no longer lethal, and adults are overall healthy. These findings, together with high conservation of -29E in humans, open a path to develop genetic therapies for people with achondroplasia.