The tumor suppressor PTEN regulates cell migration, growth, and survival by removing the 3′-phosphate of phosphoinositides. Exposure of purified PTEN or of cells to H2O2 resulted in inactivation of PTEN in a time- and H2O2concentration-dependent manner. Analysis of various cysteine mutants, including mass spectrometry of tryptic peptides, indicated that the essential Cys124 residue in the active site of PTEN specifically forms a disulfide with Cys71during oxidation by H2O2. The reduction of H2O2-oxidized PTEN in cells appears to be mediated predominantly by thioredoxin. Thus, thioredoxin was more efficient than glutaredoxin, glutathione, or a 14-kDa thioredoxin-like protein with regard to the reduction of oxidized PTEN in vitro. Thioredoxin co-immunoprecipitated with PTEN from cell lysates; and incubation of cells with 2,4-dinitro-1-chlorobenzene (an inhibitor of thioredoxin reductase) delayed the reduction of oxidized PTEN, whereas incubation with buthioninesulfoximine (an inhibitor of glutathione biosynthesis) did not. These results suggest that the reversible inactivation of PTEN by H2O2might be important for the accumulation of 3′-phosphorylated phosphoinositides and that the uncontrolled generation of H2O2 associated with certain pathological conditions might contribute to cell proliferation by inhibiting PTEN function. The tumor suppressor PTEN regulates cell migration, growth, and survival by removing the 3′-phosphate of phosphoinositides. Exposure of purified PTEN or of cells to H2O2 resulted in inactivation of PTEN in a time- and H2O2concentration-dependent manner. Analysis of various cysteine mutants, including mass spectrometry of tryptic peptides, indicated that the essential Cys124 residue in the active site of PTEN specifically forms a disulfide with Cys71during oxidation by H2O2. The reduction of H2O2-oxidized PTEN in cells appears to be mediated predominantly by thioredoxin. Thus, thioredoxin was more efficient than glutaredoxin, glutathione, or a 14-kDa thioredoxin-like protein with regard to the reduction of oxidized PTEN in vitro. Thioredoxin co-immunoprecipitated with PTEN from cell lysates; and incubation of cells with 2,4-dinitro-1-chlorobenzene (an inhibitor of thioredoxin reductase) delayed the reduction of oxidized PTEN, whereas incubation with buthioninesulfoximine (an inhibitor of glutathione biosynthesis) did not. These results suggest that the reversible inactivation of PTEN by H2O2might be important for the accumulation of 3′-phosphorylated phosphoinositides and that the uncontrolled generation of H2O2 associated with certain pathological conditions might contribute to cell proliferation by inhibiting PTEN function. Hydrogen peroxide (H2O2) is produced by all mammalian cells as a by-product of normal metabolism, including the oxidative phosphorylation of ADP and the conversion of arachidonic acid to leukotrienes, as well as by phagocytic cells in the host defense response to noxious stimuli. In addition, ultraviolet and γ irradiation of cells results in the production of H2O2. A substantial increase in the intracellular concentration of H2O2 is generally associated with deleterious effects, including cell death by apoptosis or necrosis, in pathophysiological conditions such as inflammation and ischemia-reperfusion. The generation of H2O2 also appears to be required, however, for many normal cellular functions, including propagation of receptor signaling (1Rhee, S. G., Bae, Y. S., Lee, S.-R., and Kwon, J. (2000)Science stke(www.stke.org/cgi/contentfull/OC_sigtrans;2000/53/pe1)Google Scholar, 2Finkel T. Curr. Opin. Cell Biol. 1998; 10: 248-253Crossref PubMed Scopus (1019) Google Scholar). Ligands that induce an increase in the intracellular concentration of H2O2 include peptide growth factors such as platelet-derived growth factor (PDGF) 1The abbreviations used are: PDGFplatelet-derived growth factorDTTdithiothreitolTrxthioredoxinTrxRthioredoxin reductaseDMEMDulbecco's modified Eagle's mediumHAhemagglutininGrxglutaredoxinNEMN-ethylmaleimidePI(34,5)P3, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphateHPLChigh-performance liquid chromatographyDNCB2,4-dinitro-1-chlorobenzeneBSObuthioninesulfoximineGSHreduced glutathioneMALDI-TOFmatrix-assisted laser desorption ionization time-of-flightPI(45)P2, phosphatidylinositol 4,5-biphosphatePI(34)P2, phosphatidylinositol 3,4-biphosphate and epidermal growth factor, cytokines such as transforming growth factor β1 and tumor necrosis factor α, and agonists of heterotrimeric GTP-binding protein (G protein)-coupled receptors such as N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) and angiotensin II (1Rhee, S. G., Bae, Y. S., Lee, S.-R., and Kwon, J. (2000)Science stke(www.stke.org/cgi/contentfull/OC_sigtrans;2000/53/pe1)Google Scholar, 2Finkel T. Curr. Opin. Cell Biol. 1998; 10: 248-253Crossref PubMed Scopus (1019) Google Scholar). The essential role of H2O2 production in intracellular signaling triggered by PDGF (3Sundaresan M. Yu Z.X. Ferrans V.J. Irani K. Finkel T. Science. 1995; 270: 296-299Crossref PubMed Scopus (2342) Google Scholar, 4Brar S.S. Kennedy T.P. Whorton A.R. Murphy T.M. Chitano P. Hoidal J.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 20017-20026Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (87) Google Scholar), epidermal growth factor (5Bae Y.S. Kang S.W. Seo M.S. Baines I.C. Tekle E. Chock P.B. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1997; 272: 217-221Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1109) Google Scholar), angiotensin II (6Ushio-Fukai M. Alexander R.W. Akers M. Yin Q. Fujio Y. Walsh K. Griendling K.K. J. Biol. Chem. 1999; 274: 22699-22704Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (501) Google Scholar), and cell-cell contact (7Pani G. Colavitti R. Bedogni B. Anzevino R. Borrello S. Galeotti T. J. Biol. Chem. 2000; 275: 38891-38899Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (131) Google Scholar) has been demonstrated by the observation that corresponding receptor-mediated events are abrogated by blocking the accumulation of H2O2 with enzymes such as catalase or small molecules such as N-acetylcysteine. platelet-derived growth factor dithiothreitol thioredoxin thioredoxin reductase Dulbecco's modified Eagle's medium hemagglutinin glutaredoxin N-ethylmaleimide 4,5)P3, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate high-performance liquid chromatography 2,4-dinitro-1-chlorobenzene buthioninesulfoximine reduced glutathione matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight 5)P2, phosphatidylinositol 4,5-biphosphate 4)P2, phosphatidylinositol 3,4-biphosphate The addition of exogenous H2O2 or the intracellular production of this metabolite in response to receptor stimulation affects the function of a variety of proteins including transcription factors, protein kinases and phosphatases, phospholipases, ion channels, and G proteins (1Rhee, S. G., Bae, Y. S., Lee, S.-R., and Kwon, J. (2000)Science stke(www.stke.org/cgi/contentfull/OC_sigtrans;2000/53/pe1)Google Scholar, 2Finkel T. Curr. Opin. Cell Biol. 1998; 10: 248-253Crossref PubMed Scopus (1019) Google Scholar). However, the mechanisms by which H2O2 achieves these effects remain unknown. It is unlikely that H2O2specifically binds proteins and thereby affects their functions. On the other hand, H2O2 is a mild oxidant that is able to oxidize cysteine residues in proteins to cysteine sulfenic acid or to disulfide, both of which are readily reduced back to cysteine by various cellular reductants. Because the p Ka (where Ka is the acid constant) of the sulfhydryl group (Cys–SH) of most cysteine residues is ∼8.5 (8Besse D. Siedler F. Diercks T. Kessler H. Moroder L. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997; 36: 883-885Crossref Scopus (118) Google Scholar) and because this group is less readily oxidized by H2O2 than the cysteine thiolate anion (Cys–S–), few proteins might be expected to possess a Cys–SH that is vulnerable to oxidation by H2O2 in cells. However, certain protein cysteine residues do exist as thiolate anions at neutral pH as a result of the lowering of their p Ka values by charge interactions between the negatively charged thiolate and nearby positively charged amino acid residues (9Kim J.R. Yoon H.W. Kwon K.S. Lee S.R. Rhee S.G. Anal. Biochem. 2000; 283: 214-221Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar). Proteins with low p Ka cysteine residues include protein tyrosine phosphatases (10Jia Z. Barford D. Flint A.J. Tonks N.K. Science. 1995; 268: 1754-1758Crossref PubMed Scopus (566) Google Scholar, 11Denu J.M. Dixon J.E. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998; 2: 633-641Crossref PubMed Scopus (340) Google Scholar, 12Lee S.R. Kwon K.S. Kim S.R. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 15366-15372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (848) Google Scholar). All protein tyrosine phosphatases contain an essential cysteine residue (p Ka, 4.7–5.4) in the signature active site motif, HC XXG XXRS/T (where X is any amino acid residue), that exists as a thiolate anion at neutral pH (11Denu J.M. Dixon J.E. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998; 2: 633-641Crossref PubMed Scopus (340) Google Scholar). This thiolate anion contributes to formation of a thiol-phosphate intermediate in the catalytic mechanism of protein tyrosine phosphatases. The active site cysteine is the target of specific oxidation by various oxidants, including H2O2, and this modification is reversed by incubation with thiol compounds such as dithiothreitol (DTT) and reduced glutathione (GSH). The ability of intracellularly produced H2O2 to inhibit protein tyrosine phosphatase activity was demonstrated by the observation that stimulation of A431 cells with epidermal growth factor resulted in a selective reduction in the extent of subsequent labeling of the active site cysteine residue of protein tyrosine phosphatase 1B by [3H]iodoacetic acid in cell lysates (12Lee S.R. Kwon K.S. Kim S.R. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 15366-15372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (848) Google Scholar). PTEN is a member of the protein tyrosine phosphatase family and reverses the action of phosphoinositide 3-kinase by catalyzing the removal of the phosphate attached to the 3′-hydroxyl group of the phosphoinositide inositol ring (13Maehama T. Dixon J.E. J. Biol. Chem. 1998; 273: 13375-13378Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2646) Google Scholar, 14Maehama T. Dixon J.E. Trends Cell Biol. 1999; 9: 125-128Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (513) Google Scholar, 15Maehama T. Taylor G.E. Dixon J.E. Annu. Rev. Biochem. 2001; 70: 247-279Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar). By negatively modulating the phosphoinositide 3-kinase-Akt signaling pathway, PTEN functions as an important tumor suppressor (15Maehama T. Taylor G.E. Dixon J.E. Annu. Rev. Biochem. 2001; 70: 247-279Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar, 16Furnari F.B. Lin H. Huang H.S. Cavenee W.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 12479-12484Crossref PubMed Scopus (386) Google Scholar, 17Stambolic V. Suzuki A. de la Pompa J.L. Brothers G.M. Mirtsos C. Sasaki T. Ruland J. Penninger J.M. Siderovski D.P. Mak T.W. Cell. 1998; 95: 29-39Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2146) Google Scholar, 18Myers M.P. Pass I. Batty I.H. Van der Kaay J. Stolarov J.P. Hemmings B.A. Wigler M.H. Downes C.P. Tonks N.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 13513-13518Crossref PubMed Scopus (1023) Google Scholar, 19Li D.M. Sun H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 15406-15411Crossref PubMed Scopus (441) Google Scholar, 20Cantley L.C. Neel B.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 4240-4245Crossref PubMed Scopus (1768) Google Scholar). We now show that H2O2 induces reversible inactivation of PTEN through oxidation of the essential Cys124 and the formation by this residue of a disulfide with Cys71 and that the PTEN disulfide is reduced by thioredoxin (Trx). Given that stimulation of various receptors induces H2O2 production, we propose that the receptor-mediated activation of phosphoinositide 3-kinase may not be sufficient for the accumulation of 3′-phosphorylated phosphoinositides; the concomitant inactivation of PTEN by H2O2produced in response to receptor stimulation might also be necessary for this effect. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum, penicillin, and streptomycin were from Invitrogen. Both PDGF-BB and rabbit polyclonal antibodies to PTEN were obtained from Upstate Biotechnology, and monoclonal antibodies to PTEN and to the hemagglutinin (HA) epitope tag were from Santa Cruz Biotechnology. Horseradish peroxidase-conjugated antibodies to mouse or rabbit immunoglobulin G were from Amersham Biosciences. Recombinant Trx and glutaredoxin (Grx) were prepared as described previously (12Lee S.R. Kwon K.S. Kim S.R. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 15366-15372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (848) Google Scholar). Thioredoxin reductase (TrxR) was prepared as described previously (21Lee S.R. Bar-Noy S. Kwon J. Levine R.L. Stadtman T.C. Rhee S.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 2521-2526Crossref PubMed Scopus (228) Google Scholar). Glucose oxidase, GSH, DTT, and N-ethylmaleimide (NEM) were from Sigma. Bovine xanthine oxidase and catalase were from Roche Molecular Biochemicals, and xanthine was from Calbiochem. A 30% solution of H2O2 was from Fisher. Human PTEN cDNA cloned in the pQE30 vector (Qiagen) for expression of the protein with a histidine tag at the NH2 terminus was kindly provided by K. M. Yamada (National Institutes of Health). The cDNAs encoding the PTEN mutants C71S, C83S, C105S, C124S, and C136S were generated by polymerase chain reaction-mediated site-directed mutagenesis and verified by DNA sequencing. The histidine-tagged wild-type and mutant proteins were expressed in Escherichia coli according to standard procedures and purified with the use of an immobilized nickel resin (Qiagen). The purified proteins were dialyzed against 50 mm Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 mmEDTA, 10% glycerol, and 10 mm 2-mercaptoethanol and then stored at –80 °C. The phosphatase activity of PTEN was assayed with32P-labeled phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PI(3,4,5)P3) as described previously (13Maehama T. Dixon J.E. J. Biol. Chem. 1998; 273: 13375-13378Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2646) Google Scholar). HeLa and NIH 3T3 cells were grown at 37 °C under an atmosphere of 5% CO2 in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. The cDNAs encoding wild-type PTEN or the C124S mutant tagged at their NH2 termini with HA were subcloned into the pCGN plasmid (22Tanaka M. Herr W. Cell. 1990; 60: 375-386Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (599) Google Scholar), and the resulting vectors were introduced into NIH 3T3 cells by transfection with the use of Effectene (Qiagen). After stimulation, cells (1 × 106 cells in 1 ml of DMEM) were scraped into 0.2 ml of ice-cold 50% trichloroacetic acid and transferred to microfuge tubes. The cell suspensions were sonicated briefly and then centrifuged at 2000 × g for 5 min. The supernatants were removed, and the pellets were washed with acetone and then solubilized in 0.2 ml of 100 mm Tris-HCl (pH 6.8) buffer containing 2% SDS and 40 mm NEM. Portions (5 μl) of the solubilized pellets were subjected to SDS-PAGE under nonreducing conditions, and the separated proteins were transferred electrophoretically to a nitrocellulose membrane. The membrane was then subjected to immunoblot analysis with either rabbit antibodies to PTEN or a monoclonal antibody to HA. Immune complexes were detected with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies and enhanced chemiluminescence reagents (AmershamBiosciences or Pierce). The intensity of PTEN bands was quantitated with an Image Station 440 instrument (Kodak Digital Science). Oxidized PTEN (100 μg) was obtained by incubating the purified protein for 5 min at room temperature in a final volume of 20 μl containing 50 mm Hepes-NaOH (pH 7.0), 150 mm NaCl, and 1 mm H2O2; the reaction was stopped by the addition of 1 μg of catalase. The protein was then denatured with 6 m guanidine-HCl in 100 mm Tris-HCl (pH 9.0), and the free cysteine residues were alkylated by incubation for 2 h with 10 mmiodoacetamide in an anaerobic chamber. Alkylated PTEN was digested overnight at 37 °C with Lys-C (0.5 μg/ml) in 100 mmTris-HCl (pH 8.5) containing 10% acetonitrile. The digestion products were then fractionated by HPLC on a C18 column with a linear gradient (0–60%) of acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid at a flow rate of 1 ml/min. A peak that eluted at 30.5 min was exposed or not exposed to 10 mm DTT for 10 min and then analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry. Purified human PTEN was inactivated by H2O2 in a concentration-dependent manner (Fig. 1A). PTEN was also inactivated on incubation with xanthine oxidase and xanthine, the combination of which results in the generation of superoxide anions that are subsequently converted to H2O2 (Fig. 1B). The inactivation of PTEN by the xanthine oxidase-xanthine system was inhibited by up to ∼80% by catalase (Fig. 1B), suggesting that PTEN oxidation was mediated predominantly by H2O2 rather than by superoxide anions. PTEN that had been treated with H2O2 migrated faster on SDS-PAGE under nonreducing conditions than did the untreated protein (Fig. 2A). This observation suggested that H2O2 induces the oxidation of sulfhydryl groups of PTEN to a disulfide, a reaction that generally results in a more compact protein structure. The PTEN protein comprises 403 amino acids, with the catalytic domain located in the NH2-terminal region and a C2 domain present in the COOH-terminal region (23Lee J.O. Yang H. Georgescu M.M., Di Cristofano A. Maehama T. Shi Y. Dixon J.E. Pandolfi P. Pavletich N.P. Cell. 1999; 99: 323-334Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (894) Google Scholar). The catalytic domain of human PTEN contains cysteines at positions 71, 83, 105, 124, and 136 (15Maehama T. Taylor G.E. Dixon J.E. Annu. Rev. Biochem. 2001; 70: 247-279Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar). To identify the cysteine residues that form a disulfide, we changed each of these five cysteines in the catalytic domain individually to serine, thereby generating the mutants C71S, C83S, C105S, C124S, and C136S. The mutant proteins were incubated with H2O2 and then analyzed by gel electrophoresis. Like the wild-type protein, the C83S, C105S, and C136S mutants migrated faster after exposure to H2O2, whereas the mobility of the C71S and C124S mutants was not affected by H2O2 (Fig. 2A). These results thus suggested that, on oxidation with H2O2, the Cys124 residue in the active site of PTEN forms a disulfide bond with Cys71. To demonstrate directly the formation of a disulfide bond between Cys71 and Cys124 of PTEN, we subjected the H2O2-treated protein to alkylation under denaturing conditions with iodoacetamide (to block free cysteines) and then to digestion with the endoproteinase Lys-C. The resulting peptides were fractionated by reversed-phase HPLC. A peak that eluted at 30.5 min (data not shown) revealed several components on analysis by MALDI-TOF mass spectrometry, including one of 4432.86 mass units (Fig. 2B); this size is highly similar to the value of 4435.88 mass units calculated for a 37-residue fragment of PTEN in which a Cys71-containing peptide and a Cys124-containing peptide are bridged by a disulfide bond. When the HPLC peak fraction that eluted at 30.5 min was treated with DTT before analysis by mass spectrometry, no mass peak corresponding to the 37-residue fragment was detected; instead, fragments of 1696.37 and 2741.02 mass units, similar to the values of 1695.90 and 2741.98 mass units calculated for the 14-residue Cys71-containing peptide and the 23-residue Cys124-containing peptide, respectively, were apparent (Fig. 2B). These results thus demonstrate that Cys71 and Cys124 of PTEN form a disulfide on exposure to H2O2. This conclusion is consistent with the crystal structure of PTEN, which reveals that, among the four other cysteine residues in the catalytic domain, only Cys71 is sufficiently close (a distance of 5.9 Å) to Cys124 to form a disulfide with this residue (23Lee J.O. Yang H. Georgescu M.M., Di Cristofano A. Maehama T. Shi Y. Dixon J.E. Pandolfi P. Pavletich N.P. Cell. 1999; 99: 323-334Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (894) Google Scholar). We examined whether PTEN is oxidized in cells exposed to H2O2. NIH 3T3 cells were incubated for 5 min with various concentrations of H2O2, after which cell extracts were exposed to NEM to block free sulfhydryls and then subjected to immunoblot analysis with antibodies to PTEN. Exposure of cells to H2O2 at concentrations as low as 50 μm resulted in the appearance of the higher mobility (oxidized) form of PTEN, and the intensity of this band increased as the concentration of H2O2 increased (Fig. 3A). The amount of the oxidized form of PTEN also increased with time of incubation of cells with 0.5 mm H2O2, reaching a maximum at 10–40 min and decreasing gradually thereafter (Fig. 3B). The amount of the reduced form of the protein decreased as the amount of the oxidized form increased and vice versa, suggesting that PTEN was inactivated by H2O2 and then reactivated by cellular reductants as the concentration of H2O2 declined. When extracts derived from NIH 3T3 cells treated with H2O2 were incubated with DTT before gel electrophoresis, only the lower mobility PTEN band was detected (Fig. 3, A and B), consistent with the notion that the higher mobility form of the protein contains a disulfide. To demonstrate that Cys124 contributes to the disulfide responsible for the increase in PTEN mobility, we transfected NIH 3T3 cells separately with vectors encoding either the C124S mutant of human PTEN tagged with HA or the HA-tagged wild-type protein. Exposure of the transfected cells to H2O2revealed that the HA-tagged wild-type protein, but not the HA-tagged C124S mutant, underwent reversible oxidation (Fig. 3C), confirming that Cys124 forms the disulfide bond responsible for the mobility shift of PTEN. The reversible inactivation of PTEN was also apparent in HeLa cells exposed to 1.5 mm H2O2 (Fig. 4A). When HeLa cells were incubated in a medium in which H2O2 was produced continuously as a result of the presence of glucose oxidase (which converts molecular oxygen to H2O2 with electrons derived from the glucose also present in the medium), the oxidized form of PTEN persisted (Fig. 4B). Two prominent physiological electron donors for protein reduction are GSH and Trx (24Holmgren A. Antioxid. Redox Signal. 2000; 2: 811-820Crossref PubMed Scopus (434) Google Scholar). GSH reduces proteins either directly or indirectly through the regeneration of Grx after its reaction with oxidized proteins. Oxidized Trx is reduced by TrxR with the use of electrons supplied by NADPH. Purified PTEN that had been inactivated by exposure to glucose and glucose oxidase was incubated with electron donors, and the extent of its reduction was monitored on the basis of the mobility shift in nonreducing gels (Fig. 5A). The most rapid reduction was achieved with the nonphysiological electron donor DTT (5 mm). The Trx system, comprising 5 μm Trx and saturating concentrations of TrxR and NADPH, was almost as efficient as DTT; the Trx system devoid of Trx was completely inactive (data not shown). GSH (5 mm) was markedly less effective than the Trx system, and the presence of 5 μm Grx in addition to 5 mm GSH (the Grx system) did not substantially increase the efficiency of the latter (Fig. 5A). Similar results were obtained when PTEN reduction was monitored on the basis of enzyme activity (data not shown). We also measured the rate of PTEN reactivation in the presence of various concentrations of Trx (Fig. 5B). Half-maximal reactivation was apparent at 1 μm Trx. Furthermore, immunoblot analysis revealed that Trx was co-immunoprecipitated with PTEN from NIH 3T3 cell extracts (Fig. 6). Estimation of the relative amounts of PTEN and Trx in the immunoprecipitates by comparison of the band intensities with those of protein standards yielded a molar ratio of PTEN to Trx of 1:0.07. Mammalian cells contain a 14-kDa protein, which is 20% identical to Trx in amino acid sequence. This Trx-related protein, named TRP14, contains a WC XXC motif, which is conserved among the members of the thiol-disulfide oxidoreductase superfamily that includes Trx, Grx, and protein disulfide isomerases. The reduction potentials of TRP14 (−0.257 V) and Trx (−0.274 V) are similar, and oxidized TRP14 and Trx were reduced with equal efficiency by TrxR. 2W. Jeong and S. G. Rhee, unpublished data. As such, we tested whether TRP14 can reactivate oxidized PTEN in the presence of TrxR and NADPH. TRP14 was nearly as ineffective as GSH, further suggesting the specificity of electron donor molecules (Fig. 7). To evaluate the relative importance of GSH and Trx with regard to reactivation of PTEN in cells, we incubated HeLa cells with either 2,4-dinitro-1-chlorobenzene (DNCB), which prevents recycling of Trx by inhibiting TrxR activity (25Nordberg J. Zhong L. Holmgren A. Arner E.S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 10835-10842Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar), or buthioninesulfoximine (BSO), which inhibits GSH biosynthesis (26Griffith O.W. Meister A. J. Biol. Chem. 1979; 254: 7558-7560Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), before exposure to H2O2. Treatment of cells with 100 μm DNCB for 15 min resulted in the accumulation of >80% of Trx in its oxidized form, and treatment with 300 μmBSO for 24 h resulted in the depletion of GSH by >90% (data not shown). Whereas BSO did not substantially affect the reduction of H2O2-oxidized PTEN, DNCB induced a marked delay in PTEN reduction (Fig. 8), suggesting that the reduction of PTEN in cells is mediated predominantly by Trx. DNCB is known to be toxic and induce cell death upon incubation for several hours (27Ishikawa A. Kubota Y. Murayama T. Nomura Y. Neurosci. Lett. 1999; 277: 99-102Crossref PubMed Scopus (24) Google Scholar). Incubation of HeLa cells with 100 μmDNCB for 15 min, however, did not cause any detectable cell death as measured by the trypan blue exclusion assay, and detectable levels of cell death were apparent after incubation for 90 min (data not shown). A variety of cellular stimuli induce the activation of phosphoinositide 3-kinase, resulting in the conversion of PI(4,5)P2 to PI(3,4,5)P3 (28Fruman D.A. Meyers R.E. Cantley L.C. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 481-507Crossref PubMed Scopus (1328) Google Scholar, 29Vanhaesebroeck B. Leevers S.J. Ahmadi K. Timms J. Katso R. Driscoll P.C. Woscholski R. Parker P.J. Waterfield M.D. Annu. Rev. Biochem. 2001; 70: 535-602Crossref PubMed Scopus (1383) Google Scholar). The latter lipid is dephosphorylated back to PI(4,5)P2 by PTEN (13Maehama T. Dixon J.E. J. Biol. Chem. 1998; 273: 13375-13378Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2646) Google Scholar) or to PI(3,4)P2 by 5-phosphatases such as SHIP (30Majerus P.W. Kisseleva M.V. Norris F.A. J. Biol. Chem. 1999; 274: 10669-10672Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (193) Google Scholar). There are at least nine distinct mammalian 5-phosphatases (31Kisseleva M.V. Wilson M.P. Majerus P.W. J. Biol. Chem. 2000; 275: 20110-20116Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (118) Google Scholar), and the catalytic cores of all of them contain two signature active site motifs, (F/I)W XGD XN(F/Y)R and (R/N)XP(S/A)(W/Y)(C/T)DR; these motifs, unlike the active site motif of the 3-phosphatase PTEN, do not possess a conserved cysteine residue, however. The 3′-phosphorylated phosphoinositides bind and modulate numerous proteins that regulate a variety of cellular functions (15Maehama T. Taylor G.E. Dixon J.E. Annu. Rev. Biochem. 2001; 70: 247-279Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar, 29Vanhaesebroeck B. Leevers S.J. Ahmadi K. Timms J. Katso R. Driscoll P.C. Woscholski R. Parker P.J. Waterfield M.D. Annu. Rev. Biochem. 2001; 70: 535-602Crossref PubMed Scopus (1383) Google Scholar). One of the best-characterized targets of PI(3,4,5)P3 and PI(3,4)P2 is the protein kinase Akt. Both PI(3,4,5)P3 and PI(3,4)P2 activate Akt (20Cantley L.C. Neel B.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 4240-4245Crossref PubMed Scopus (1768) Google Scholar), although their relative contribution to this process in vivo remains unclear (32Kisseleva M.V. Cao L. Majerus P.W. J. Biol. Chem. 2002; 277: 6266-6272Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (85) Google Scholar). Activated Akt promotes cell survival by phosphorylating the proapoptotic factors BAD and caspase-9 and thereby inhibiting their functions (33Datta S.R. Dudek H. Tao X. Masters S., Fu, H. Gotoh Y. Greenberg M.E. Cell. 1997; 91: 231-241Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4999) Google Scholar, 34Cardone M.H. Roy N. Stennicke H.R. Salvesen G.S. Franke T.F. Stanbridge E. Frisch S. Reed J.C. Science. 1998; 282: 1318-1321Crossref PubMed Scopus (2748) Google Scholar). Unchecked activation of Akt may thus lead to tumor formation (17Stambolic V. Suzuki A. de la Pompa J.L. Brothers G.M. Mirtsos C. Sasaki T. Ruland J. Penninger J.M. Siderovski D.P. Mak T.W. Cell. 1998; 95: 29-39Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2146) Google Scholar, 35Wu X. Senechal K. Neshat M.S. Whang Y.E. Sawyers C.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 15587-15591Crossref PubMed Scopus (598) Google Scholar). PTEN opposes this proliferation signaling pathway by reducing the cellular abundance of PI(3,4,5)P3 and PI(3,4)P2 and blocking Akt activation (17Stambolic V. Suzuki A. de la Pompa J.L. Brothers G.M. Mirtsos C. Sasaki T. Ruland J. Penninger J.M. Siderovski D.P. Mak T.W. Cell. 1998; 95: 29-39Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2146) Google Scholar, 35Wu X. Senechal K. Neshat M.S. Whang Y.E. Sawyers C.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 15587-15591Crossref PubMed Scopus (598) Google Scholar). Exogenous H2O2 induces the activation of Akt (6Ushio-Fukai M. Alexander R.W. Akers M. Yin Q. Fujio Y. Walsh K. Griendling K.K. J. Biol. Chem. 1999; 274: 22699-22704Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (501) Google Scholar, 36Konishi H. Matsuzaki H. Tanaka M. Takemura Y. Kuroda S. Ono Y. Kikkawa U. FEBS Lett. 1997; 410: 493-498Crossref PubMed Scopus (240) Google Scholar, 37Wang X. McCullough K.D. Franke T.F. Holbrook N.J. J. Biol. Chem. 2000; 275: 14624-14631Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (408) Google Scholar). However, the 3′-phosphorylated phosphoinositide that accumulates in response to H2O2 is almost exclusively PI(3,4)P2 rather than PI(3,4,5)P3(24Holmgren A. Antioxid. Redox Signal. 2000; 2: 811-820Crossref PubMed Scopus (434) Google Scholar, 38Van der Kaay J. Beck M. Gray A. Downes C.P. J. Biol. Chem. 1999; 274: 35963-35968Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (107) Google Scholar). Given that H2O2 activates receptor-type protein tyrosine kinases such as the PDGF receptor and the epidermal growth factor receptor (37Wang X. McCullough K.D. Franke T.F. Holbrook N.J. J. Biol. Chem. 2000; 275: 14624-14631Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (408) Google Scholar, 39Knebel A. Rahmsdorf H.J. Ullrich A. Herrlich P. EMBO J. 1996; 15: 5314-5325Crossref PubMed Scopus (470) Google Scholar, 40Goldkorn T. Balaban N. Matsukuma K. Chea V. Gould R. Last J. Chan C. Chavez C. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1998; 19: 786-798Crossref PubMed Scopus (176) Google Scholar), it also likely activates phosphoinositide 3-kinase, resulting in the production of PI(3,4,5)P3. In support of this notion, H2O2-dependent activation of Akt is blocked by the phosphoinositide 3-kinase inhibitor wortmannin (6Ushio-Fukai M. Alexander R.W. Akers M. Yin Q. Fujio Y. Walsh K. Griendling K.K. J. Biol. Chem. 1999; 274: 22699-22704Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (501) Google Scholar, 37Wang X. McCullough K.D. Franke T.F. Holbrook N.J. J. Biol. Chem. 2000; 275: 14624-14631Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (408) Google Scholar,41Salsman S. Felts N. Pye Q.N. Floyd R.A. Hensley K. Arch. Biochem. Biophys. 2001; 386: 275-280Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar). We have now shown that PTEN is inactivated by H2O2. This observation, together with the fact that PTEN, but not 5-phosphatases, contains an oxidizable cysteine residue at its active site, suggests that in cells exposed to H2O2, PI(3,4,5)P3 synthesized by phosphoinositide 3-kinase activity is rapidly dephosphorylated by 5-phosphatases that are insensitive to H2O2, whereas dephosphorylation at the 3′ position is markedly inhibited as a result of inactivation of PTEN by H2O2. The H2O2-dependent inhibition of the lipid phosphatase activity of the tumor suppressor PTEN suggests that H2O2 produced under pathological conditions, such as during chronic inflammation, might contribute to inhibition of apoptosis, to hyperplasia, and to tumor formation. Indeed, many normal cells exposed to H2O2exhibit increased proliferation and express growth-related genes (42Burdon R.H. Free Radic. Biol. Med. 1995; 18: 775-794Crossref PubMed Scopus (1075) Google Scholar, 43Nose K. Shibanuma M. Kikuchi K. Kageyama H. Sakiyama S. Kuroki T. Eur. J. Biochem. 1991; 201: 99-106Crossref PubMed Scopus (275) Google Scholar, 44Datta R. Hallahan D.E. Kharbanda S.M. Rubin E. Sherman M.L. Huberman E. Weichselbaum R.R. Kufe D.W. Biochemistry. 1992; 31: 8300-8306Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar). Furthermore, given that tumor cells produce large amounts of H2O2 (45Szatrowski T.P. Nathan C.F. Cancer Res. 1991; 51: 794-798PubMed Google Scholar, 46Irani K. Xia Y. Zweier J.L. Sollott S.J. Der C.J. Fearon E.R. Sundaresan M. Finkel T. Goldschmidt-Clermont P.J. Science. 1997; 275: 1649-1652Crossref PubMed Scopus (1449) Google Scholar), this metabolite might also promote tumor cell proliferation. Previously, the tumor-promoting activity of reactive oxygen species has been explained mainly in terms of the mutagenic activity of the hydroxyl radicals derived from them. A variety of cell surface receptor ligands induce the production of H2O2, which is necessary for receptor-mediated cellular events such as chemotaxis, DNA synthesis, and cell cycle progress (3Sundaresan M. Yu Z.X. Ferrans V.J. Irani K. Finkel T. Science. 1995; 270: 296-299Crossref PubMed Scopus (2342) Google Scholar, 47Page K., Li, J. Wang Y. Kartha S. Pestell R.G. Hershenson M.B. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2000; 23: 436-443Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar). Like exogenous H2O2, the receptor-produced H2O2 also likely causes PTEN inactivation and contributes to the accumulation of 3′-phosphorylated phosphoinositides. Thus, the receptor-mediated activation of phosphoinositide 3-kinase may not be sufficient for the accumulation of 3′-phosphorylated phosphoinositides, and the concomitant inactivation of PTEN by receptor-produced H2O2 might also be necessary for this effect. Despite numerous studies demonstrating the importance of PTEN in cell growth, survival, and migration, the mechanisms by which the activity of this protein is regulated have remained unclear (15Maehama T. Taylor G.E. Dixon J.E. Annu. Rev. Biochem. 2001; 70: 247-279Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar). PTEN contains tandem phosphatase and C2 domains, which share an extensive interface (23Lee J.O. Yang H. Georgescu M.M., Di Cristofano A. Maehama T. Shi Y. Dixon J.E. Pandolfi P. Pavletich N.P. Cell. 1999; 99: 323-334Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (894) Google Scholar). The phosphatase domain exhibits substantial structural homology to protein tyrosine phosphatases, but it contains an enlarged active site with several basic residues that are important for the accommodation of the bulky inositol trisphosphate moiety. PTEN also contains a putative PDZ domain-binding motif at its COOH terminus. Although this notion remains controversial (48Georgescu M.M. Kirsch K.H. Akagi T. Shishido T. Hanafusa H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 10182-10187Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar, 49Tolkacheva T. Chan A.M. Oncogene. 2000; 19: 680-689Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar, 50Leslie N.R. Gray A. Pass I. Orchiston E.A. Downes C.P. Biochem. J. 2000; 346: 827-833Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar), the C2 domain and the PDZ domain-binding motif have been proposed to mediate the translocation of PTEN from the cytosol to sites near to PI(3,4,5)P3 (23Lee J.O. Yang H. Georgescu M.M., Di Cristofano A. Maehama T. Shi Y. Dixon J.E. Pandolfi P. Pavletich N.P. Cell. 1999; 99: 323-334Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (894) Google Scholar, 51Wu X. Hepner K. Castelino-Prabhu S., Do, D. Kaye M.B. Yuan X.J. Wood J. Ross C. Sawyers C.L. Whang Y.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 4233-4238Crossref PubMed Scopus (341) Google Scholar, 52Wu Y. Dowbenko D. Spencer S. Laura R. Lee J., Gu, Q. Lasky L.A. J. Biol. Chem. 2000; 275: 21477-21485Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (233) Google Scholar, 53Adey N.B. Huang L. Ormonde P.A. Baumgard M.L. Pero R. Byreddy D.V. Tavtigian S.V. Bartel P.L. Cancer Res. 2000; 60: 35-37PubMed Google Scholar). Phosphorylation of PTEN by casein kinase II has also been shown to increase the susceptibility of the protein to proteasome-mediated degradation (54Torres J. Pulido R. J. Biol. Chem. 2001; 276: 993-998Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (544) Google Scholar). How these modes of regulation might be affected by the activation of cell surface receptors, however, is not known. Although in vitro measurements of its lipid phosphatase activity suggest that PTEN might be constitutively active, no mechanism for its negative regulation has previously been revealed (15Maehama T. Taylor G.E. Dixon J.E. Annu. Rev. Biochem. 2001; 70: 247-279Crossref PubMed Scopus (411) Google Scholar). Constitutive activity of PTEN is likely required to prevent accumulation of PI(3,4,5)P3 and unwanted triggering of proliferation signals in quiescent cells. The oxidative inactivation of PTEN in response to H2O2 generation might therefore be an important determinant of the timing and localization of the production of this important lipid messenger elicited by receptor stimulation. Oxidized PTEN is gradually converted back to the reduced form by intracellular reducing agents, indicating that the reversible oxidation and reduction of the active site cysteine residue is an important mechanism for the regulation of PTEN. The best candidate for the intracellular reducing agent is Trx, given that oxidized PTEN was reduced much more effectively by Trx than by Grx or GSH in vitro. Furthermore, depletion of reduced Trx, but not of GSH, markedly reduced the rate of reactivation of oxidized PTEN in cells. The association of Trx with PTEN revealed by the co-immunoprecipitation of these proteins suggests that the reduction reaction might be governed by a specific interaction between oxidized PTEN and reduced thioredoxin. Such a specific interaction is also supported by the observation that a 14-kDa Trx-related protein (TRP14) was not able to reduce oxidized PTEN despite the fact that it contains a WC XXC motif, which is conserved among members of the thiol-disulfide oxidoreductase superfamily, and that TRP14 and Trx exhibit similar redox potentials and reactivity toward TrxR. We thank K. Yamada for PTEN cDNA cloned in the pQE30 vector.

Stimulation of cells with various peptide growth factors induces the production of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3) through activation of phosphatidylinositol 3-kinase. The action of this enzyme is reversed by that of the tumor suppressor PTEN. With the use of cells overexpressing NADPH oxidase 1 or peroxiredoxin II, we have now shown that H2O2 produced in response to stimulation of cells with epidermal growth factor or platelet-derived growth factor potentiates PIP3 generation and activation of the protein kinase Akt induced by these growth factors. We also show that a small fraction of PTEN molecules is transiently inactivated as a result of oxidation of the essential cysteine residue of this phosphatase in various cell types stimulated with epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, or insulin. These results suggest that the activation of phosphatidylinositol 3-kinase by growth factors might not be sufficient to induce the accumulation of PIP3 because of the opposing activity of PTEN and that the concomitant local inactivation of PTEN by H2O2 might be needed to increase the concentration of PIP3 sufficiently to trigger downstream signaling events. Furthermore, together with previous observations, our data indicate that peroxiredoxin likely participates in PIP3 signaling by modulating the local concentration of H2O2.

By following peroxiredoxin I (Prx I)-dependent NADPH oxidation spectrophotometrically, we observed that Prx I activity decreased gradually with time. The decay in activity was coincident with the conversion of Prx I to a more acidic species as assessed by two-dimensional gel electrophoresis. Mass spectral analysis and studies with Cys mutants determined that this shift in pI was due to selective oxidation of the catalytic site Cys51-SH to Cys51-SO2H. Thus, Cys51-SOH generated as an intermediate during catalysis appeared to undergo occasional further oxidation to Cys51-SO2H, which cannot be reversed by thioredoxin. The presence of H2O2 alone was not sufficient to cause oxidation of Cys51 to Cys51-SO2H. Rather, the presence of complete catalytic components (H2O2, thioredoxin, thioredoxin reductase, and NADPH) was necessary, indicating that such hyperoxidation occurs only when Prx I is engaged in the catalytic cycle. Likewise, hyperoxidation of Cys172/Ser172 mutant Prx I required not only H2O2, but also a catalysis-supporting thiol (dithiothreitol). Kinetic analysis of Prx I inactivation in the presence of a low steady-state level (<1 μm) of H2O2 indicated that Prx I was hyperoxidized at a rate of 0.072% per turnover at 30 °C. Hyperoxidation of Prx I was also detected in HeLa cells treated with H2O2. By following peroxiredoxin I (Prx I)-dependent NADPH oxidation spectrophotometrically, we observed that Prx I activity decreased gradually with time. The decay in activity was coincident with the conversion of Prx I to a more acidic species as assessed by two-dimensional gel electrophoresis. Mass spectral analysis and studies with Cys mutants determined that this shift in pI was due to selective oxidation of the catalytic site Cys51-SH to Cys51-SO2H. Thus, Cys51-SOH generated as an intermediate during catalysis appeared to undergo occasional further oxidation to Cys51-SO2H, which cannot be reversed by thioredoxin. The presence of H2O2 alone was not sufficient to cause oxidation of Cys51 to Cys51-SO2H. Rather, the presence of complete catalytic components (H2O2, thioredoxin, thioredoxin reductase, and NADPH) was necessary, indicating that such hyperoxidation occurs only when Prx I is engaged in the catalytic cycle. Likewise, hyperoxidation of Cys172/Ser172 mutant Prx I required not only H2O2, but also a catalysis-supporting thiol (dithiothreitol). Kinetic analysis of Prx I inactivation in the presence of a low steady-state level (<1 μm) of H2O2 indicated that Prx I was hyperoxidized at a rate of 0.072% per turnover at 30 °C. Hyperoxidation of Prx I was also detected in HeLa cells treated with H2O2. peroxiredoxin thioredoxin thioredoxin reductase dithiothreitol 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid high performance liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry tandem mass spectrometry matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry Peroxiredoxins are a family of peroxidases that reduce hydrogen peroxide and alkyl hydroperoxides to water and alcohol, respectively, with the use of reducing equivalents provided by thiol-containing proteins (1Chae H.Z. Chung S.J. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1994; 269: 27670-27678Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 2Rhee S.G. Kang S.W. Chang T.S. Jeong W. Kim K. International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life. 2001; 52: 35-41Crossref Scopus (512) Google Scholar, 3Hofmann B. Hecht H.J. Flohé L. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 2002; 383: 347-364Crossref PubMed Scopus (768) Google Scholar). The first peroxiredoxin (Prx)1 proteins to be discovered were a 25-kDa yeast protein initially called thiol-specific antioxidant enzyme (4Kim K. Kim I.H. Lee K.Y. Rhee S.G. Stadtman E.R. J. Biol. Chem. 1988; 263: 4704-4711Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 5Kim I.H. Kim K. Rhee S.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 6018-6022Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar, 6Chae H.Z. Kim I.H. Kim K. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1993; 268: 16815-16821Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), and a 21-kDa Salmonella typhimurium alkyl-hydroperoxide reductase termed AhpC (7Tartaglia L.A. Storz G. Ames B.N. J. Mol. Biol. 1989; 210: 709-719Crossref PubMed Scopus (145) Google Scholar, 8Storz G. Jacobson F.S. Tartaglia L.A. Morgan R.W. Silveira L.A. Ames B.N. J. Bacteriol. 1989; 171: 2049-2055Crossref PubMed Scopus (205) Google Scholar, 9Tartaglia L.A. Storz G. Brodsky M.H. Lai A. Ames B.N. J. Biol. Chem. 1990; 265: 10535-10540Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 10Chae H.Z. Robison K. Poole L.B. Church G. Storz G. Rhee S.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7017-7021Crossref PubMed Scopus (697) Google Scholar). Subsequently, a mammalian homolog of thiol-specific antioxidant/AhpC was purified; and it, together with thiol-specific antioxidant and AhpC, defined a family of peroxidases that now includes six mammalian isoforms (Prx I–VI) and members identified in organisms from each kingdom (3Hofmann B. Hecht H.J. Flohé L. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 2002; 383: 347-364Crossref PubMed Scopus (768) Google Scholar, 10Chae H.Z. Robison K. Poole L.B. Church G. Storz G. Rhee S.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7017-7021Crossref PubMed Scopus (697) Google Scholar, 11Chae H.Z. Rhee S.G. Biofactors. 1994; 4: 177-180PubMed Google Scholar). All Prx proteins contain a conserved Cys residue, which corresponds to Cys51 in mammalian Prx I, in the N-terminal portion of the molecule (10Chae H.Z. Robison K. Poole L.B. Church G. Storz G. Rhee S.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7017-7021Crossref PubMed Scopus (697) Google Scholar, 11Chae H.Z. Rhee S.G. Biofactors. 1994; 4: 177-180PubMed Google Scholar). The majority of Prx proteins, including four (Prx I–IV) of six mammalian peroxiredoxins, contain an additional conserved Cys residue in the C-terminal region that corresponds to Cys172 in mammalian Prx I (2Rhee S.G. Kang S.W. Chang T.S. Jeong W. Kim K. International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life. 2001; 52: 35-41Crossref Scopus (512) Google Scholar, 3Hofmann B. Hecht H.J. Flohé L. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 2002; 383: 347-364Crossref PubMed Scopus (768) Google Scholar, 12Matsumoto A. Okado A. Fujii T. Fujii J. Egashira M. Niikawa N. Taniguchi N. FEBS Lett. 1999; 443: 246-250Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar, 13Seo M.S. Kang S.W. Kim K. Baines I.C. Lee T.H. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 2000; 275: 20346-20354Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (378) Google Scholar). The Prx enzymes containing two conserved Cys residues are thus called 2-Cys Prx, in comparison with a small number of Prx proteins termed 1-Cys Prx, which contain only one conserved cysteine residue in the N-terminal domain (2Rhee S.G. Kang S.W. Chang T.S. Jeong W. Kim K. International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life. 2001; 52: 35-41Crossref Scopus (512) Google Scholar, 10Chae H.Z. Robison K. Poole L.B. Church G. Storz G. Rhee S.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7017-7021Crossref PubMed Scopus (697) Google Scholar). In 2-Cys Prx enzymes, the N-terminal conserved cysteine is oxidized by H2O2 to cysteine-sulfenic acid (Cys51-SOH), which then reacts with Cys172-SH of the other subunit to produce an intermolecular disulfide (1Chae H.Z. Chung S.J. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1994; 269: 27670-27678Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 14Chae H.Z. Uhm T.B. Rhee S.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7022-7026Crossref PubMed Scopus (280) Google Scholar). Reduction of the disulfide intermediate of Prx I–IV is specific in that it can be achieved by thioredoxin (Trx), but not by GSH or glutaredoxin (15Kang S.W. Chae H.Z. Seo M.S. Kim K. Baines I.C. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 6297-6302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (613) Google Scholar, 16Jin D.Y. Chae H.Z. Rhee S.G. Jeang K.T. J. Biol. Chem. 1997; 272: 30952-30961Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (385) Google Scholar). Thus, the reducing equivalents for the peroxidase activity of Prx I–IV are ultimately derived from NADPH via thioredoxin reductase (TrxR) and Trx. Not all Prx enzymes containing both conserved Cys residues are reduced by Trx: the bacterial Prx AhpC is reduced by AhpF, which contains both Trx and TrxR domains (10Chae H.Z. Robison K. Poole L.B. Church G. Storz G. Rhee S.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7017-7021Crossref PubMed Scopus (697) Google Scholar, 17Jacobson F.S. Morgan R.W. Christman M.F. Ames B.N. J. Biol. Chem. 1989; 264: 1488-1496Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). In the absence of a physiological electron donor, the peroxidase activities of 2-Cys Prx enzymes can be supported by small thiol molecules such as dithiothreitol (DTT) and 2-mercaptoethanol, but not by GSH (1Chae H.Z. Chung S.J. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1994; 269: 27670-27678Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 14Chae H.Z. Uhm T.B. Rhee S.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 7022-7026Crossref PubMed Scopus (280) Google Scholar, 15Kang S.W. Chae H.Z. Seo M.S. Kim K. Baines I.C. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 6297-6302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (613) Google Scholar). In 1-Cys Prx enzymes, including mammalian Prx VI, the conserved cysteine is also the site of oxidation, but remains in a sulfenic acid state upon oxidation because there is no nearby partner cysteine to form a disulfide bond (18Kang S.W. Baines I.C. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 6303-6311Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (407) Google Scholar, 19Choi H.J. Kang S.W. Yang C.H. Rhee S.G. Ryu S.E. Nat. Struct. Biol. 1998; 5: 400-406Crossref PubMed Scopus (330) Google Scholar). Trx cannot reduce this sulfenic acid-containing intermediate (18Kang S.W. Baines I.C. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 6303-6311Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (407) Google Scholar, 20Fujii T. Fujii J. Taniguchi N. Eur. J. Biochem. 2001; 268: 218-225Crossref PubMed Google Scholar). GSH has been proposed to be the electron donor, but these data remain controversial (18Kang S.W. Baines I.C. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 6303-6311Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (407) Google Scholar, 20Fujii T. Fujii J. Taniguchi N. Eur. J. Biochem. 2001; 268: 218-225Crossref PubMed Google Scholar, 21Fisher A.B. Dodia C. Manevich Y. Chen J.W. Feinstein S.I. J. Biol. Chem. 1999; 274: 21326-21334Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (243) Google Scholar, 22Singh A.K. Shichi H. J. Biol. Chem. 1998; 273: 26171-26178Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (67) Google Scholar, 23Peshenko I.V. Novoselov V.I. Evdokimov V.A. Nikolaev Y.V. Kamzalov S.S. Shuvaeva T.M. Lipkin V.M. Fesenko E.E. Free Radic. Biol. Med. 1998; 25: 654-659Crossref PubMed Scopus (48) Google Scholar). The crystal structures of 2-Cys and 1-Cys Prx enzymes reveal that the catalytic cysteine is located in a small pocket formed by the N- and C-terminal domains of the two subunits (19Choi H.J. Kang S.W. Yang C.H. Rhee S.G. Ryu S.E. Nat. Struct. Biol. 1998; 5: 400-406Crossref PubMed Scopus (330) Google Scholar, 24Hirotsu S. Abe Y. Okada K. Nagahara N. Hori H. Nishino T. Hakoshima T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 12333-12338Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar, 25Schröder E. Littlechild J.A. Lebedev A.A. Errington N. Vagin A.A. Isupov M.N. Struct. Fold. Des. 2000; 8: 605-615Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (275) Google Scholar, 26Alphey M.S. Bond C.S. Tetaud E. Fairlamb A.H. Hunter W.N. J. Mol. Biol. 2000; 300: 903-916Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 27Wood Z.A. Poole L.B. Hantgan R.R. Karplus P.A. Biochemistry. 2002; 41: 5493-5504Crossref PubMed Scopus (293) Google Scholar). The reactive cysteine is thus protected from larger oxidant molecules that contain disulfide linkages. The structures also show that the N-terminal conserved cysteine is surrounded by positively charged amino acid residues, which stabilize the thiolate (Cys-S−) anion. The thiolate anion is more readily oxidized by peroxides than its protonated thiol counterpart (Cys-SH) (28Kim J.R. Yoon H.W. Kwon K.S. Lee S.R. Rhee S.G. Anal. Biochem. 2000; 283: 214-221Crossref PubMed Scopus (242) Google Scholar). This provides the mechanistic basis for the observed sensitivity of the active-site cysteine to oxidation by peroxides. Previously, we reported that Prx purified from yeast is readily inactivated during catalysis (1Chae H.Z. Chung S.J. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1994; 269: 27670-27678Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). We speculated that such inactivation occurs if the sulfenic acid moiety of the reaction intermediate is further oxidized by H2O2 to cysteinesulfinic acid (Cys-SO2H) before disulfide formation with Cys172 can occur (1Chae H.Z. Chung S.J. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1994; 269: 27670-27678Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Sulfinic acid cannot be reduced by the Trx or DTT included in the assay mixture. Recently, Mitsumotoet al. (29Mitsumoto A. Takanezawa Y. Okawa K. Iwamatsu A. Nakagawa Y. Free Radic. Biol. Med. 2001; 30: 625-635Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar) used two-dimensional PAGE to compare proteins in human umbilical vein endothelial cells before and after exposure of the cells to H2O2. In H2O2-treated cells, a number of proteins (including Prx I and Prx II) demonstrated altered migration consistent with decreased pI, suggesting that such oxidative inactivation might also occur in cells. However, these acidic Prx enzymes were not characterized in detail. We have now investigated the mechanism of human Prx I inactivation by H2O2. Here, we demonstrate that the enzyme inactivation and concomitant acidic shift of Prx on two-dimensional gels are due in fact to the conversion of the active-site cysteine to Cys-SO2H. Furthermore, we observed that only those Prx molecules actively engaged in the catalytic cycle are vulnerable to oxidative inactivation. The construction of a bacterial expression vector for human Prx I (pETprxI-WT) has been described (15Kang S.W. Chae H.Z. Seo M.S. Kim K. Baines I.C. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 6297-6302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (613) Google Scholar). Two Prx I mutants in which Cys51 and Cys172 were individually replaced by serine residues (C51S and C172S, respectively) were generated by standard PCR-mediated site-directed mutagenesis with pETprxI-WT as the template and complementary primers containing a single-base mismatch that converts the codon for Cys to one for Ser. The final mutated PCR products were ligated into the pET vector to generate pETprxI-C51S and pETprxI-C172S.Escherichia coli BL21(DE3) competent cells (Novagen) were transformed with pETprxI-WT, pETprxI-C51S, or pETprxI-C172S; cultured at 37 °C overnight in 100 ml of LB medium supplemented with ampicillin (100 μg/ml); and then transferred to 10 liters of fresh LB medium in a Microferm fermentor (New Brunswick Scientific). When the absorbance of the culture at 600 nm reached 0.6–0.8, expression was induced by isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside at a final concentration of 0.4 mm. After incubation for an additional 3 h, the cells were collected by centrifugation, frozen in liquid nitrogen, and stored at −70 °C until used. The recombinant proteins were purified as described (30Chae H.Z. Kang S.W. Rhee S.G. Methods Enzymol. 1999; 300: 219-226Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar). NADPH oxidation coupled to the reduction of H2O2 was monitored at 30 °C as a decrease inA 340 using a Hewlett-Packard Model 8453 UV-visible spectrophotometer equipped with a thermostable cell holder and a multicell transport. The reaction was initiated by addition of the indicated concentration of Prx I to a 200-μl reaction mixture containing 50 mm Hepes-NaOH (pH 7.0), 1 mmEDTA, 0.8 μm TrxR, and the indicated concentrations of H2O2, NADPH, and Trx. HeLa S3 cells were adapted to suspension growth in Spinner minimum essential medium (Quality Biological, Inc.) supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (Invitrogen). The cells were grown to a density of 1 × 106 cells/ml and maintained by dilution with fresh complete medium every 4 days. HeLa S3 cells were rinsed three times with ice-cold phosphate-buffered saline and lysed in lysis buffer (8 murea, 4% CHAPS, and 40 mm Tris base) by sonication in a sonic bath three to four times for 30 s. After removal of insoluble materials by centrifugation at 14,000 × gfor 30 min, cell lysates were mixed with 10 volumes of rehydration buffer (8 m urea, 2% CHAPS, 0.5% immobilized pH gradient buffer, 20 mm DTT, and 0.005% bromphenol blue) and loaded onto immobilized pH gradient strips (pH 3–10, nonlinear). Isoelectric focusing on an IPGPhor isoelectrofocusing unit (Amersham Biosciences) and preparation (reduction and alkylation) of the immobilized pH gradient strips for the second-dimension SDS-PAGE were carried out according to the procedures recommended by the manufacturer. SDS-PAGE was conducted on 12% gels using an AmershamBiosciences SE600 vertical unit, and the protein spots were visualized by staining with silver nitrate. For immunoblot analyses of Prx enzymes, proteins on two-dimensional gels were transferred electrophoretically to a nitrocellulose membrane, and the membrane was incubated with rabbit antibodies to Prx I. Immune complexes were detected with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies and enhanced chemiluminescence reagents (Amersham Biosciences or Pierce). Silver-stained two-dimensional gels were scanned with a Molecular Dynamics SI personal densitometer. Reverse-phase HPLC analyses were performed using an Agilent 1100 HPLC system with a Vydac 218TP54 column (0.47 mm × 25 cm). For protein analysis, injected samples were eluted at 1 ml/min with a 5–35% (v/v) acetonitrile/water gradient containing 0.04% (v/v) trifluoroacetic acid over 15 min and with a 35–60% gradient over the next 15 min. Gradients of 5–10% over 10 min, 10–40% over 30 min, and 40–60% over 30 min were used for peptide analysis. A Finnigan MAT LCQ electrospray ion-trap mass spectrometer was used for analysis of Prx I proteins and sequence analysis of Cys51-containing peptides. Dried HPLC fractions dissolved in 75% acetonitrile and 0.1% acetic acid were introduced at 1 μl/min using a syringe pump. Data were collected for positive ions at 300–2000 m/z using the following settings: capillary temperature, 215 °C; maximum ion inject time, 100 ms; full scan target, 9 × 107; and three microscans/full scan. For proteins, ESI-MS spectra were obtained and used to calculate the masses of proteins by deconvolution using Finnigan MAT BioWorks software. For sequence analysis of peptides, once the parent ions were identified, the mass spectrometer was set up to obtain collision-induced dissociation MS/MS spectra of the parent ions. The instrument for MS/MS spectra was configured as follows: capillary temperature, 215 °C; maximum ion inject time, 100 ms; full scan target, 2 × 107; three microscans/full scan; mass window, 2.5; and collision energy, used within a range of 0–50%. Mass spectrometry analysis of the tryptic peptides was performed on a Voyager-STR MALDI-TOF instrument (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) equipped with a nitrogen laser. Samples were dissolved in 50% acetonitrile and 5% formic acid, mixed with 10 mg/ml 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid; Aldrich) in 0.1% trifluoroacetic acid and 70% acetonitrile, and spotted on a sample plate. The spectra were obtained in the positive-ion reflector or linear mode with delayed extraction under standard conditions. Spectra were analyzed using DataExplorer software (PerSeptive Biosystems). Standard peptides were used for calibration of peptides, whereas apomyoglobin and carbonic anhydrase were used as internal standards for mass scale calibration of proteins. The peroxidase activity of human Prx I was monitored by following the decrease inA 340 attributable to the oxidation of NADPH in a reaction mixture containing NADPH, Trx, TrxR, and varying concentrations of H2O2. The initial rate of NADPH oxidation (the slope at t = 0) was independent of H2O2 at saturating concentrations (0.1–1 mm) (K m for H2O2< 20 μm (31Chae H.Z. Kim H.J. Kang S.W. Rhee S.G. Diabetes Res. Clin. Pract. 1999; 45: 101-112Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (317) Google Scholar)) (Fig.1 A). However, the rate decreased with time, and the higher the H2O2concentration, the faster the rate of decrease. The H2O2 concentration dependence of this decrease is shown more quantitatively by plotting the rate of NADPH oxidation (the first derivative of the NADPH oxidation curve) versustime (Fig. 1 B). Replenishment of Prx I was shown to restore the enzyme rate, indicating that the markedly decreased NADPH oxidation rate was not attributable to exhaustion of substrate or to product inhibition (data not shown). Reactions containing 200 μmH2O2 were stopped at 0, 60, and 150 s, and the resulting samples were subjected to two-dimensional PAGE analysis. A single spot at a position corresponding to a pI value of 8.1 (the theoretical pI of Prx I is 8.2) was observed at 0 s. At 60 s, however, a new spot whose intensity was similar to that of the original spot appeared at a more acidic position (pI 7.6). At 150 s, the intensity of the acidic spot was enhanced at the expense of the original spot. The increasing proportion of the acidic species compared with the original spot is consistent with the notion that the 50 and 80% decreases in rate observed at 60 and 150 s, respectively, are related to the conversion of Prx I to a more acidic derivative. To identify the modification responsible for the acidic shift, Prx I was oxidized for 5 min in the presence of 1 mm H2O2 and 10 mm DTT. Reduced and oxidized enzymes were separated from the reaction mixture by reverse-phase HPLC (Fig.2 A). The molecular masses of the separated proteins were measured by ESI-MS (Fig. 2 B). The masses calculated fromm/z and total charge of multiply charged ions of the reduced and oxidized enzymes were 21,979 and 22,011 Da, respectively. The mass of the reduced enzyme was in good agreement with the theoretical mass of 21,979.2 Da. The difference of 32 mass units between the reduced and oxidized Prx I enzymes suggests the presence of two additional oxygen atoms in the oxidized species. To determine the site of oxidation, the reduced and oxidized Prx I enzymes separated in Fig. 2 A were digested with trypsin, and the resultant peptides were fractionated by reverse-phase HPLC (Fig.2 C). The HPLC elution profiles of the reduced and oxidized Prx I peptides were nearly identical except between 48 and 56 min (Fig.2 C). Major peptide peaks from the reduced and oxidized proteins were collected and analyzed by MALDI-TOF-MS, enabling the assignment of 12 such peaks to defined fragments of Prx I. In addition to the disulfide-forming Cys51 and Cys172residues, Prx I contains two additional cysteine residues at positions 70 and 82. In both the reduced and oxidized states, the Cys172-containing peptide encompassing residues 168–189 eluted from the HPLC column at 26.1 min. Peptides containing both Cys70 and Cys82 were also unchanged: in both states, the peptides encompassing residues 67–91 (representing one missed trypsin cleavage site at Lys67) and residues 68–91 eluted at 35.5 and 36.8 min, respectively. However, retention of Cys51-containing peptides was altered by oxidation. In the reduced state, the peptides encompassing residues 27–61 (representing two missed trypsin cleavage sites at Lys34 and Lys36), residues 35–61 (representing one missed cleavage site at Lys36), and residues 37–61 eluted at 50.8, 51.7, and 55.1 min, respectively (Fig. 2 D). In the oxidized protein, however, none of these peaks corresponding to the three Cys51-containing peptides were observed. Instead, several peaks eluted near the expected positions. When the peaks at 49.7, 50.4, and 53.0 min were analyzed by MALDI-TOF-MS, each of them displayed a dominant and a minor ion separated by 16 mass units (Fig.2 D). Furthermore, the dominant ions derived from the oxidized peptides eluting at 49.7, 50.4, and 53.0 min were each larger by 32 mass units than those derived from reduced peptides encompassing residues 27–61, 35–61, and 37–61, respectively (Fig. 2 Dand Table I). These results support a model wherein Cys51-SH, but not Cys70-SH, Cys82-SH, or Cys172-SH, is hyperoxidized by H2O2 to Cys-SO2H and cysteic acid (Cys-SO3H).Table ICharacterization of Cys51-containing peptidesResiduesRetention timeMassSequenceTheoretical1-aTheoretical averagem/z values of singly charged ions ([M + H]+) calculated using GPMAW software (Lighthouse Data, Odense, Denmark).m/zObserved1-bAverage of at least three separate experiments with S.D. <0.02%.m/zmin27–611-cCys51-SH-containing peptide.50.84145.84145.4DISLSDYKGKYVVFFFYPLDFTFVCPTEIIAFSDR27–61-O2 1-dCys51-SO2H-containing peptide.49.74177.84177.527–61-O3 1-eCys51-SO3H-containing peptide.4193.84193.135–611-cCys51-SH-containing peptide.51.73223.83222.9GKYVVFFFYPLDFTFVCPTEIIAFSDR35–61-O2 1-dCys51-SO2H-containing peptide.50.43255.83254.935–61-O3 1-eCys51-SO3H-containing peptide.3271.83270.837–611-cCys51-SH-containing peptide.55.13038.53038.3YVVFFFYPLDFTFVCPTEIIAFSDR37–61-O2 1-dCys51-SO2H-containing peptide.53.03070.53070.337–61-O3 1-eCys51-SO3H-containing peptide.3086.53086.11-a Theoretical averagem/z values of singly charged ions ([M + H]+) calculated using GPMAW software (Lighthouse Data, Odense, Denmark).1-b Average of at least three separate experiments with S.D. <0.02%.1-c Cys51-SH-containing peptide.1-d Cys51-SO2H-containing peptide.1-e Cys51-SO3H-containing peptide. Open table in a new tab To demonstrate directly the formation of Cys51-SO2H, the amino acid sequence of the dominant ion ([M + 2H]2+, m/z1535.90) derived from peptide 37–61 was determined from the masses of the fragments arising from collision-induced dissociation of the peptide. The collision-induced dissociation MS/MS spectrum of the ion is shown in Fig. 2 E, along with the interpretation. The major daughter ions are y10 (m/z1148.5) and b15 (m/z 1922.5) ions, which derive from cleavage of the peptide bond between Cys51 and Pro52. The mass differences between b14 and b15 (135.2 Da), between y10and y11 (135.0 Da), and between z10 and z11 (135.0 Da) clearly indicate the presence of Cys-SO2H at Cys51. Mass spectral analysis of the tryptic peptides suggested that peroxide oxidation of Prx I Cys51 yielded mainly Cys51-SO2H, but also Cys51-SO3H to a lesser extent. In Fig. 2, Prx I was digested with trypsin for only 3 h before HPLC analysis. However, when oxidized Prx I was digested overnight with trypsin, Cys51-SO3H-containing peptides became the major products (data not shown). Furthermore, purified Cys51-SO2H-containing peptides were slowly autoxidized to Cys51-SO3H-containing peptides upon exposure to air (data not shown). However, longer exposure of intact Prx I to either H2O2 or air did not increase cysteic acid content (data not shown). Therefore, it appears that the formation of cysteic acid derivatives is the result of the air oxidation of Cys-SO2H-containing peptides. The sensitivity of Cys-SO2H to air has been reported (32Poole L.B. Claiborne A. J. Biol. Chem. 1989; 264: 12330-12338Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Cysteines 51 and 172 were individually replaced by serine residues to generate the C51S and C172S mutant enzymes, respectively. The wild-type and mutant enzymes were subjected to two-dimensional PAGE analysis before and after incubation with a peroxidase reaction mixture containing H2O2, NADPH, Trx, and TrxR (Fig.3). As observed in Fig. 1 C, the wild-type enzyme migrated predominantly to the more acidic position upon incubation with H2O2, suggesting that Cys51-SH was hyperoxidized to Cys-SO2H. As expected, no such shift was observed for C51S. C172S, which is catalytically inactive because Cys172-SH is required for disulfide formation by Cys51-SOH, did not undergo hyperoxidation. In contrast, when reducing equivalents were provided by DTT rather than by the Trx system (Trx, TrxR, and NADPH), C172S became hyperoxidized just as the wild-type enzyme did, whereas C51S was still resistant to hyperoxidation. As previously shown with a yeast Prx mutant in which the C-terminal conserved Cys was changed to Ser (1Chae H.Z. Chung S.J. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1994; 269: 27670-27678Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), C172S is fully active when supported by DTT even though it lacks peroxidase activity in the presence of the Trx system (data not shown). Such catalysis is possible because a small diffusible thiol molecule like DTT can replace Cys172-SH in the formation of a disulfide with Cys51-SOH. The disulfide is subsequently reduced by DTT. These results indicate that oxidation of Cys51-SH to Cys51-SO2H occurs only when Prx is engaged in the catalytic cycle. To further examine whether the accumulation of the hyperoxidized protein requires continuous passage through the catalytic cycle, Prx I was inactivated by incubation with H2O2, NADPH, TrxR, and varying concentrations of Trx. An aliquot of the reaction mixture was removed at various times and assayed for peroxidase activity by measuring NADPH oxidation coupled to H2O2 reduction. For each Trx concentration, the initial rate of NADPH oxidation was plotted against duration of inactivation to yield rates of enzyme inactivation (Fig.4 A). Prx I inactivation proceeded slowly in the absence of Trx and increased gradually with increasing Trx concentrations, reaching saturation at 4 μm Trx. The Trx dependence of inactivation is displayed by plotting the residual activities measured after a 3-min incubation with the inactivation reaction mixture against Trx concentration. Half-maximal inactivation occurred at <0.5 μm Trx. When either TrxR or NADPH was omitted from the i