Abstract

 The XPC-HR23B complex is specifically involved in global genome but not transcription-coupled nucleotide excision repair (NER). Its function is unknown. Using a novel DNA damage recognition-competition assay, we identified XPC-HR23B as the earliest damage detector to initiate NER: it acts before the known damage-binding protein XPA. Coimmunoprecipitation and DNase I footprinting show that XPC-HR23B binds to a variety of NER lesions. These results resolve the function of XPC-HR23B, define the first NER stages, and suggest a two-step mechanism of damage recognition involving damage detection by XPC-HR23B followed by damage verification by XPA. This provides a plausible explanation for the extreme damage specificity exhibited by global genome repair. In analogy, in the transcription-coupled NER subpathway, RNA polymerase II may take the role of XPC. After this subpathway-specific initial lesion detection, XPA may function as a common damage verifier and adaptor to the core of the NER apparatus.

Oxidative stress and mutagenic DNA lesions formed by reactive oxygen species (ROS) are linked to human malignancy. Clinical treatments inducing chronic oxidative stress may therefore carry a risk of therapy-related cancer. We suggest that immunosuppression by azathioprine (Aza) may be one such treatment. Aza causes the accumulation of 6-thioguanine (6-TG) in patients' DNA. Here we demonstrate that biologically relevant doses of ultraviolet A (UVA) generate ROS in cultured cells with 6-TG–substituted DNA and that 6-TG and UVA are synergistically mutagenic. A replication-blocking DNA 6-TG photoproduct, guanine sulfonate, was bypassed by error-prone, Y-family DNA polymerases in vitro. A preliminary analysis revealed that in five of five cases, Aza treatment was associated with a selective UVA photosensitivity. These findings may partly explain the prevalence of skin cancer in long-term survivors of organ transplantation.

The xeroderma pigmentosum group C (XPC) protein complex plays a key role in recognizing DNA damage throughout the genome for mammalian nucleotide excision repair (NER). Ultraviolet light (UV)-damaged DNA binding protein (UV-DDB) is another complex that appears to be involved in the recognition of NER-inducing damage, although the precise role it plays and its relationship to XPC remain to be elucidated. Here we show that XPC undergoes reversible ubiquitylation upon UV irradiation of cells and that this depends on the presence of functional UV-DDB activity. XPC and UV-DDB were demonstrated to interact physically, and both are polyubiquitylated by the recombinant UV-DDB-ubiquitin ligase complex. The polyubiquitylation altered the DNA binding properties of XPC and UV-DDB and appeared to be required for cell-free NER of UV-induced (6-4) photoproducts specifically when UV-DDB was bound to the lesion. Our results strongly suggest that ubiquitylation plays a critical role in the transfer of the UV-induced lesion from UV-DDB to XPC.

Article15 June 2000free access Mechanisms of accurate translesion synthesis by human DNA polymerase η Chikahide Masutani Chikahide Masutani Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, and CREST, Japan Science and Technology Corporation , 1-3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan Search for more papers by this author Rika Kusumoto Rika Kusumoto Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, and CREST, Japan Science and Technology Corporation , 1-3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan The Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Osaka University, 1-6 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan Search for more papers by this author Shigenori Iwai Shigenori Iwai Biomolecular Engineering Research Institute, 6-2-3 Furuedai, Suita, Osaka, 565-0874 Japan Search for more papers by this author Fumio Hanaoka Corresponding Author Fumio Hanaoka Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, and CREST, Japan Science and Technology Corporation , 1-3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan RIKEN (The Institute of Physical and Chemical Research), Wako-shi, Saitama, 351-0198 Japan Search for more papers by this author Chikahide Masutani Chikahide Masutani Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, and CREST, Japan Science and Technology Corporation , 1-3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan Search for more papers by this author Rika Kusumoto Rika Kusumoto Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, and CREST, Japan Science and Technology Corporation , 1-3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan The Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Osaka University, 1-6 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan Search for more papers by this author Shigenori Iwai Shigenori Iwai Biomolecular Engineering Research Institute, 6-2-3 Furuedai, Suita, Osaka, 565-0874 Japan Search for more papers by this author Fumio Hanaoka Corresponding Author Fumio Hanaoka Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, and CREST, Japan Science and Technology Corporation , 1-3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan RIKEN (The Institute of Physical and Chemical Research), Wako-shi, Saitama, 351-0198 Japan Search for more papers by this author Author Information Chikahide Masutani1, Rika Kusumoto1,2, Shigenori Iwai3 and Fumio Hanaoka 1,4 1Institute for Molecular and Cellular Biology, Osaka University, and CREST, Japan Science and Technology Corporation , 1-3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan 2The Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Osaka University, 1-6 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan 3Biomolecular Engineering Research Institute, 6-2-3 Furuedai, Suita, Osaka, 565-0874 Japan 4RIKEN (The Institute of Physical and Chemical Research), Wako-shi, Saitama, 351-0198 Japan ‡C.Masutani and R.Kusumoto contributed equally to this work *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2000)19:3100-3109https://doi.org/10.1093/emboj/19.12.3100 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The XPV (xeroderma pigmentosum variant) gene encodes human DNA polymerase η (pol η), which is involved in the replication of damaged DNA. Pol η catalyzes efficient and accurate translesion synthesis past cis-syn cyclobutane di-thymine lesions. Here we show that human pol η can catalyze translesion synthesis past an abasic (AP) site analog, N-2-acetylaminofluorene (AAF)-modified guanine, and a cisplatin-induced intrastrand cross-link between two guanines. Pol η preferentially incorporated dAMP and dGMP opposite AP, and dCMP opposite AAF-G and cisplatin-GG, but other nucleotides were also incorporated opposite these lesions. However, after incorporating an incorrect nucleotide opposite a lesion, pol η could not continue chain elongation. In contrast, after incorporating the correct nucleotide opposite a lesion, pol η could continue chain elongation, whereas pol α could not. Thus, the fidelity of translesion synthesis by human pol η relies not only on the ability of this enzyme to incorporate the correct nucleotide opposite a lesion, but also on its ability to elongate only DNA chains that have a correctly incorporated nucleotide opposite a lesion. Introduction A myriad of lesions in DNA are caused by ubiquitous environmental and endogenous genotoxic agents. These lesions can interfere with normal DNA metabolism including DNA replication, eventually resulting in mutations that lead to carcinogenesis and/or cell death. To maintain the integrity of the genetic material, cells possess multiple pathways to repair various types of DNA damage, such as nucleotide excision and base excision repair pathways (Friedberg et al., 1995). However, not all lesions on the genome can be repaired efficiently by these processes in time for DNA replication, and some types of lesion are repaired very inefficiently. To prevent acute cell death through arrested DNA replication at unrepaired lesions, cells have a mechanism, referred to as translesion synthesis, which allows DNA synthesis to proceed past lesions. Recently, a novel family of DNA polymerases that can catalyze translesion synthesis was identified (Cordonnier and Fuchs, 1999; Friedberg and Gerlach, 1999; Johnson et al., 1999c; Woodgate, 1999). Genetic evidence revealed that there are two subpathways of mutagenic and relatively accurate translesion syntheses. In Escherichia coli, two DNA polymerases named Pol IV (dinB) (Wagner et al., 1999) and Pol V (umuD′2C) (Reuven et al., 1999; Tang et al., 1999) were identified. The products of these two genes are involved in mutagenesis, suggesting that these polymerases catalyze error-prone translesion synthesis. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, Rev3 was identified as DNA polymerase ζ (Nelson et al., 1996b). Genetic studies also indicated that this gene took part in the mutagenic pathway. The human counterparts of dinB (Gerlach et al., 1999; Ogi et al., 1999) and REV3 (Gibbs et al., 1998; Lin et al., 1999) have also been identified and found to have mutagenic properties. In addition to these mutagenic DNA polymerases, human and yeast cells have another DNA polymerase named pol η. Human pol η is the product of the XPV gene, which is mutated in a cancer-prone genetic disorder, xeroderma pigmentosum variant (XP-V) (Johnson et al., 1999a; Masutani et al., 1999b). XP-V cells are defective in the replication of damaged DNA (Lehmann et al., 1975) and show hypermutability after exposure to UV irradiation or DNA-damaging agents (Maher et al., 1976; Wang et al., 1991, 1993; Misra and Vos, 1993; Waters et al., 1993; Raha et al., 1996). These in vivo observations imply that few errors are introduced when pol η carries out translesion synthesis inside the cell. Mutations in the RAD30 gene of S.cerevisiae inactivate the accurate translesion pathway (McDonald et al., 1997; Roush et al., 1998), indicating that the RAD30 gene product, yeast pol η, is also involved in this pathway. These observations are well explained by the fact that both human and yeast pol η can catalyze translesion synthesis past cis-syn di-thymine dimers by incorporating dAMP efficiently (Johnson et al., 1999b; Masutani et al., 1999a,b). Paradoxically, we have recently found that DNA synthesis by pol η using undamaged templates in vitro was highly error-prone (Matsuda et al., 2000). In order to try and resolve this paradox, we have examined the substrate range and mechanisms of translesion synthesis of the XPV gene product, human pol η. Results Processivity of human DNA polymerase η To examine the biological activities of human pol η, a recombinant protein tagged with His6 at its C-terminal side was expressed in insect cells and purified as described in Materials and methods. The histidine-tagged protein corrected the defective translesion DNA synthesis in XP-V cell extracts, and as such is biologically active (Masutani et al., 1999b). The processivity of the recombinant pol η was examined on singly primed phagemids under conditions of excess molar amounts of template–primer over enzyme. From a labeled primer of 20 nucleotides, pol η elongated DNA chains by 1–8 nucleotides as shown by enzyme titration and time course experiments (Figure 1). Thus, human pol η is a distributive polymerase like other translesion polymerases such as E.coli pol IV (dinB) (Wagner et al., 1999), pol V (umuD′2C) (Reuven et al., 1999; Tang et al., 1999) and yeast pol η (Washington et al., 1999), suggesting that the role of human pol η is restricted to incorporating a few nucleotides opposite and/or past a lesion. Under the same conditions, pol α elongated DNA chains by 1–11 nucleotides, in good agreement with previous data (Copeland and Wang, 1991). Figure 1.Processivity of human pol η. (A) Enzyme titration. Decreasing amounts of pol η (3.2, 1.6, 0.8, 0.4 and 0.2 fmol in lanes 1, 2, 3, 4 and 5, respectively) or pol α (0.3, 0.15, 0.07, 0.04 and 0.02 fmol in lanes 7, 8, 9, 10 and 11, respectively) were incubated with 500 fmol of the single-stranded phagemid template annealed to 5′-32P-labeled primer for 15 min in the reaction mixture. Lanes 6 and 12 contained no enzyme. The products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions. An autoradiogram of the gel is shown. (B) Time course. Pol η (0.8 fmol in lanes 1–5) or pol α (0.15 fmol in lanes 6–10) was incubated with 500 fmol of 5′-32P- labeled primer–templates for the indicated time periods. An autoradiogram of the gel is shown. Download figure Download PowerPoint Translesion synthesis by human DNA polymerase η To examine the translesion activity of human pol η, a 30mer DNA oligomer containing a single lesion was synthesized, annealed to a 5′-32P-labeled 16mer DNA oligomer and used as template (Figure 2). The primer on this template was positioned so that the first nucleotide was always incorporated opposite an abasic (AP) site analog or an N-2-acetylaminofluorene (AAF)-modified guanine. On templates containing a cis-syn cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) or the (6–4) photoproduct, cis-diamminedichloroplatinum(II) (cisplatin), which induces an intrastrand cross-link between two guanines, the positioning of the primer ensured that the first two nucleotides were incorporated opposite these lesions. DNA polymerase α and pol η could synthesize DNA products of up to 30mer in length equally well on the undamaged template, if enough enzyme was added (Figure 2A, E and G). As reported previously (Masutani et al., 1999a,b), pol η, but not pol α, was able to bypass the CPD on the template efficiently (Figure 2B). When the DNA template contained a (6–4) photoproduct, pol η incorporated one nucleotide opposite the first thymine and another nucleotide opposite the second thymine of the lesion in reactions containing excess enzyme, but bypass product was hardly detected (Figure 2C). Long exposure of the gel revealed that pol η gave a small amount of bypass products on the template but the reaction was much less efficient than that on any other templates used in this study (data not shown). Pol α did not incorporate any nucleotide opposite the (6–4) photoproduct. On the AP template, which contained a stable analog of the abasic site, pol α was able to incorporate one nucleotide opposite the lesion, but could not continue DNA synthesis. Pol η was also inhibited, and stopped after incorporating one nucleotide opposite the lesion, but bypass products could be obtained by adding excess amounts of the enzyme (Figure 2D). Similar results were obtained with templates containing an AAF-modified guanine and an intrastrand cross-link between two guanines created by cisplatin (Figure 2F and H). On both templates, pol α hardly incorporated any nucleotide opposite the lesions, and no bypass products were detected even in the presence of excess enzyme. In contrast, pol η gave bypass products on the AAF-G template, but DNA synthesis stopped mainly after the incorporation of two nucleotides, the second of which was incorporated opposite the A next to the lesion (Figure 2F). On the cisplatin-GG template, pol η also gave some bypass products, although most products contained only one nucleotide opposite the first G of the cross-link and especially the second nucleotide opposite the second G of the lesion (Figure 2H). From these results, we concluded that human pol η had the ability to bypass the AP analogs, AAF-G and cisplatin-GG. However, it must be mentioned that while the human pol η incorporated nucleotides opposite these lesions efficiently, only a small proportion of the incorporated nucleotides were elongated, even in the presence of an excess amount of pol η (Figure 2D, F and H, lanes 7). On the other hand, low but detectable amounts of elongated products were observed when limiting amounts of enzyme were added to the reactions (Figure 2D, F and H, lanes 5 and 6), although the products were <30 nucleotides in length, perhaps reflecting the low processivity of pol η. These results suggest that some of the lesions were bypassed in one processive reaction by pol η, but that others were never bypassed by the polymerase. Figure 2.Translesion synthesis by human pol η. Increasing amounts of pol α (4.7 and 23.6 fmol in lanes 2 and 3, respectively) or pol η (0.25, 1.4 and 7.1 fmol in lanes 5, 6 and 7, respectively) were incubated with the 5′-32P-labeled primer–templates indicated beside each panel at 37°C for 15 min in the standard reaction mixture. Lanes 1 and 4 contained no enzyme. The products were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions. The autoradiograms of the gels are shown. (A) Undamaged control for CPD and (6–4) photoproduct [(6–4)PP]. (B) CPD at the bridged TT. (C) The (6–4) photoproduct at the bridged TT. (D) The abasic analog at X. (E) Undamaged control for AAF. (F) AAF-modified guanine at the indicated site. (G) Undamaged control for cisplatin. (H) Intrastrand cross-link of two guanines by cisplatin at the indicated site. Download figure Download PowerPoint Nucleotide selectivity of human DNA polymerase η during incorporation opposite lesions To examine which kind of nucleotide could be incorporated opposite a lesion by pol η, polymerization reactions were performed in the presence of only one kind of deoxyribonucleotide (Figure 3). For these experiments, limiting amounts of pol η were used to facilitate the identification of the most efficiently incorporated nucleotide. As noted in our previous reports (Masutani et al., 1999a,b), human pol η has deoxynucleotidyl transferase activity and stops synthesis after incorporating an incorrect nucleotide even on undamaged templates (Figure 3A, E, G, I and K). This activity was more obvious when T was the template nucleotide. Under these conditions, dAMP dCMP, dGMP and dTMP were almost equally incorporated opposite T (Figure 3A), suggesting that the pol η tends to misincorporate nucleotides opposite T preferentially. The misincorporation observed in reactions containing only one kind of nucleotide would be suppressed in the presence of all four nucleotides. These observations are consistent with our recent finding that human pol η replicates undamaged DNA with low fidelity, especially when the sequence on the template nucleotide is T (Matsuda et al., 2000). On a template containing the cis-syn cyclobutane di-thymine dimer, pol η only bypassed the lesion when dAMP was incorporated as the first and second nucleotide. DNA synthesis stopped after the incorporation of another dAMP opposite the C next to the lesion (Figure 3B). As well as on undamaged template, pol η incorporated dCMP, dGMP or dTMP opposite the first T of the lesion in the reactions where only one nucleotide was included. On the template containing the (6–4) photoproduct, which pol η hardly bypasses, all four nucleotides were incorporated opposite the first thymine of the lesion, but synthesis stopped thereafter (Figure 3C). Figure 3.Nucleotide selectivity of pol η incorporation opposite lesions. Pol η (0.25 fmol in lanes 2–7) was incubated with 30mer DNA annealed to a 5′-32P-labeled 16mer (A–F, I and J) or 17mer (G, H, K and L) DNA in the presence of all four dNTPs (lane 3) or with one of the indicated dNTPs (lanes 4–7), or in the absence of dNTPs (lane 2). The autoradiograms of the gels are shown. (A) Undamaged control for the CPD and (6–4)PP templates with a 16mer primer. (B) CPD at the bridged TT with a 16mer primer. (C) The (6–4) photoproduct at the bridged TT with a 16mer primer. (D) The AP analog at X with a 16mer primer. (E) Undamaged control for the AAF-G template with a 16mer primer. (F) AAF-G at the indicated site with a 16mer primer. (G) Undamaged control for AAF-G template with a 17mer primer. (H) AAF-G at the indicated site with a 17mer primer. (I) Undamaged control for the cisplatin-GG template with a 16mer primer. (J) Cisplatin-GG at the indicated site with a 16mer primer. (K) Undamaged control for the cisplatin-GG template with a 17mer primer. (L) Cisplatin-GG at the indicated site with a 17mer primer. Download figure Download PowerPoint Similar experiments were performed with AP-, AAF-G- and cisplatin-GG-containing templates. On the AP template, the polymerase preferentially incorporated dAMP or dGMP opposite the lesion (Figure 3D). However, hardly any nucleotide was incorporated opposite T next to the lesion, even in the presence of dATP, by the enzyme present in limiting amounts. This observation is in agreement with the result that pol η mainly stopped DNA synthesis after incorporating one nucleotide opposite the AP analog site (Figure 2D). Human pol η preferentially incorporated dCMP opposite AAF-G, although the other three nucleotides were also incorporated to some extent (Figure 3F). As human pol η mainly stopped synthesis after incorporating a nucleotide opposite the A next to AAF-G (Figure 2F), we examined which nucleotide was incorporated opposite the A on this template. In contrast to reactions containing undamaged templates, where all four nucleotides were incorporated (Figure 3G), pol η preferentially incorporated dTMP opposite A on the AAF-modified template (Figure 3H). Preferential incorporation of dCMP was observed opposite the first G of cisplatin-GG, but it was not the only nucleotide incorporated (Figure 3J). On this template, the second dCMP was hardly incorporated opposite the second G of the cross-link, whereas two dCMPs were incorporated opposite GG on the undamaged template (Figure 3I). In fact, dAMP was incorporated more efficiently than dCMP using this template (Figure 3L). However, we found that dCMP was incorporated preferentially opposite the second G of cisplatin-GG in a different sequence (Vaisman et al., 2000), suggesting that nucleotide selection by pol η is influenced by the sequence context of the lesion. From these results, we concluded that although pol η could incorporate the correct nucleotides preferentially opposite the above lesions, the misincorporation rate was much higher than that expected of the XPV gene product in vivo, which carries out relatively accurate translesion synthesis (Maher et al., 1976; Wang et al., 1991, 1993). Ability of human DNA polymerase η to elongate DNA chains past lesions For lesion bypass, it is important that nucleotides are incorporated beyond the lesion after the initial incorporation of a nucleotide opposite the lesion. To test whether human pol η had this activity, we designed sets of 17mer and 18mer primers that had different sequences at their 3′ ends and examined which sequence allowed pol η to elongate past the lesion (Figure 4). The annealing of these primers to a 30mer DNA template containing a lesion placed the 3′ nucleotide of the primer opposite the lesion. When the template contained no lesion, pol η and pol α could elongate DNA more efficiently from a paired primer terminus than from a mispaired primer terminus (Figure 4A, C, F, H, J and L). However, pol η could synthesize DNA chains from a mispaired primer terminus when excess amounts of enzyme were added to the reaction. In particular, G–T mismatches at the primer terminus were elongated more efficiently than other mismatches (Figure 4A and C). When the template contained the CPD, pol η could synthesize DNA chains more efficiently from primers that had the sequence AA opposite the two thymines of the dimer (Figure 4B and D). Pol η could also elongate DNA chains from mispaired primers on the CPD template, and especially from primer termini having G opposite the dimer. However, the elongation of mispaired primers was less efficient on the CPD template than on undamaged templates (compare Figure 4B and D with A and C). As DNA synthesis by pol η was inhibited when the template contained AP, AAF-G or cisplatin-GG, the amounts of enzyme were increased 2-fold in experiments with templates containing these lesions. As for AP, pol η could elongate DNA from primers more efficiently when A rather than G was located opposite the lesion (Figure 4E). On the AAF-G template, pol η could continue DNA synthesis much more efficiently when the nucleotide opposite the lesion was C, although most of the incorporation stopped after the incorporation of one more nucleotide (Figure 4G). This is consistent with the major arrest of DNA synthesis that occurred after the incorporation of a nucleotide opposite A next to the lesion (Figure 2F). We also performed the experiment against the A next to AAF-G on the template. In this case, the primer with T opposite A was elongated, but other primers were not (Figure 4I). When the template contained cisplatin-GG, the primer containing C opposite the first G of the cross-link was used efficiently for DNA synthesis by pol η, but most of the incorporation stopped after the insertion of another nucleotide opposite the second G of the lesion (Figure 4K). This is also in agreement with the results shown in Figure 2H, which indicated that DNA synthesis mainly stopped after the incorporation of a nucleotide opposite the second G of the cross-link. Although dAMP was incorporated preferentially opposite the second G (Figure 3L), only the primer containing C opposite the second G of the cross-link was used efficiently to elongate DNA (Figure 4M). Thus, translesion synthesis past cisplatin-GG occurred only when two dCMPs were incorporated opposite two guanines at the cross-link. Pol α was unable to elongate DNA chains from any of these primer–templates containing the lesion, indicating that the critical bypass activity of pol η relies on its ability to continue elongation when the correct nucleotide has been incorporated opposite a lesion. Figure 4.Ability of pol η to elongate DNA chains past lesions. Sets of 5′-32P-labeled 17mer (A, B, E, F, G, J and K) or 18mer (C, D, H, I, L and M) primers, which contained different sequences at their 3′ ends (indicated by N, where N was A, C, G and T in lanes 1–4, 5–8, 9–12 and 13–16, respectively), were annealed to 30mer templates. Increasing amounts of pol η or pol α were incubated with these primed templates. The auto-radiograms of the gels are shown. The amounts of pol η were 0.12 fmol in lanes 2, 6, 10 and 14, 0.7 fmol in lanes 3, 7, 11 and 15 (A–D, F, H, J and L), 0.25 fmol in lanes 2, 6, 10 and 14, and 1.4 fmol in lanes 3, 7, 11 and 15 (E, G, I, K and M). Pol α (lanes 4, 8, 12 and 16) was present at 4.7 fmol. (A) Undamaged control for the CPD template with a 17mer primer. (B) CPD at the bridged TT with a 17mer primer. (C) Undamaged control for the CPD template with an 18mer primer. (D) CPD at the bridged TT with an 18mer primer. (E) The AP analog at X with a 17mer primer. (F) Undamaged control for the AAF-G template with a 17mer primer. (G) AAF-G at the indicated site with a 17mer primer. (H) Undamaged control for the AAF-G template with an 18mer primer. (I) AAF-G at the indicated site with an 18mer primer. (J) Undamaged control for the cisplatin-GG template with a 17mer primer. (K) Cisplatin-GG at the indicated site with a 17mer primer. (L) Undamaged control for the cisplatin-GG template with an 18mer primer. (M) Cisplatin-GG at the indicated site with an 18mer primer. Download figure Download PowerPoint Discussion Substrate range for bypass replication by human pol η XP-V cells are known to show hypermutability after exposure not only to UV light but also to various DNA-damaging agents (Friedberg et al., 1995). In addition, extracts from XP-V cells are reported to be defective in replicating DNA containing UV-induced CPD and AAF-modified bases (Cordeiro-Stone et al., 1997; Ensch-Simon et al., 1998; Svoboda et al., 1998; Cordonnier et al., 1999; Masutani et al., 1999a). These observations indicate that the XPV gene product, human DNA polymerase η, is involved in accurate translesion synthesis past lesions induced by chemical agents and UV-induced CPD. CPD was certainly the best substrate for bypass replication by pol η, while the (6–4) photoproduct was hardly replicated at all. We report here that pol η could replicate an AP analog, AAF-G, and cisplatin-GG, but less efficiently than CPD. These observations are consistent with the assumption that pol η evolved mainly to overcome UV radiation, a natural cause of DNA damage from ancient times. Among the major types of damage induced by UV light, the (6–4) photoproduct is repaired much more quickly than the CPD lesion by the nucleotide excision repair pathway (Friedberg et al., 1995). This explains well why pol η can deal efficiently with the CPD but hardly at all with the (6–4) photoproduct. AAF-G and cisplatin-GG are caused by chemical agents and can be repaired by the nucleotide excision repair pathway. AP sites, which can result from the depurination or depyrimidination of DNA by spontaneous hydrolysis of N-glycosylic bonds, are the most frequent type of lesion in cells and are repaired efficiently by the base excision repair pathway (Friedberg et al., 1995). Although these repair pathways mainly contribute to the removal of these lesions, it would be surprising if they were able to repair all lesions before DNA replication. Thus, human pol η may contribute to the general damage tolerance of cells by allowing replication past these lesions as well. Recent findings indicate that human cells have a set of genes encoding DNA polymerases involved in translesion synthesis, including REV3 (pol ζ) (Xiao et al., 1998; Lin et al., 1999), DINB1 (Gerlach et al., 1999; Ogi et al., 1999) and hRAD30B, which is the second homolog of yeast RAD30 (hRAD30A is another name for XPV) (McDonald et al., 1999). In yeast, pol ζ was shown to be involved in translesion synthesis past AAF-modified bases (Baynton et al., 1998) and AP sites in cooperation with Rev1 (Nelson et al., 1996a). Although the substrate specificities of novel human polymerases have not been fully determined yet, it is possible that these human gene products also contribute to the damage tolerance of cells by allowing replication bypass of certain specific lesions. Low fidelity DNA synthesis by pol η We have recently found that DNA synthesis by the human pol η on undamaged DNA is highly mutagenic (Matsuda et al., 2000). This could be due to its loose requirement for correct Watson–Crick base pairing, a property that would allow pol η to catalyze translesion synthesis past many types of lesion. In contrast, other replicative DNA polymerases strictly require correct Watson–Crick base pairing for DNA synthesis and cannot catalyze translesion synthesis efficiently (Kunkel and Bebenek, 2000). Here we have shown that human pol η is essentially an error-prone DNA polymerase. Pol η misincorporation was particularly evident when the template sequence was a T. More importantly, pol η could elongate DNA chains from mispaired template–primers especially when the 3′ nucleotide of the primer was G and located opposite T. This finding agrees well with the observation that the most frequent mutation caused by in vitro DNA replication by human pol η is a base substitution of T for C (Matsuda et al., 2000). Pol η could also elongate DNA chains from other mispaired template–primers. It must be mentioned, however, that these reactions were only observed efficiently under conditions where excess amounts of pol η were added to the reactions. This may mean that repeated attacks of pol η on the mispaired 3′ terminus of the primer are required for the elongation of DNA chains containing a mispaired template–primer. As cells possess a wide range of replicative DNA polymerases, such as δ and ϵ, that are capable of rapidly removing mispaired primer ends through their 3′ to 5′ proofreading exonuclease activities (Bambara et al., 1997; Waga and Stillman, 1998), it seems unlikely that the primer ends would be available for repeated elongation by pol η. Thus, our results suggest rather that the action of pol η may be restricted to the synthesis of a few nucleotides opposite and past the lesion to prevent mutations. The low processivity of the enzyme would restrict DNA synthesis to short patches only. In addition, cells might have some mechanism to regulate pol η. It is also possible that a protein factor exists in cells, which increases the fidelity of pol η. These possibilities should be clarified before we can understand why the translesion synthesis defective in XP-V patients is accurate. Molecular mechanisms of translesion synthesis by pol η In this study, we demonstrated that the fidelity of translesion synthesis by human pol η relies on the enzyme's ability to select the correct nucleotide to be incorporated opposite a lesion and to elongate only DNA chains that have a correctly base-paired primer terminus.

Article1 October 2003free access The comings and goings of nucleotide excision repair factors on damaged DNA Thilo Riedl Thilo Riedl Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS/INSERM/ULP, B.P. 10142, 67404 Illkirch Cedex, C.U. de Strasbourg, France Search for more papers by this author Fumio Hanaoka Fumio Hanaoka Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 1–3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan Search for more papers by this author Jean-Marc Egly Corresponding Author Jean-Marc Egly Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS/INSERM/ULP, B.P. 10142, 67404 Illkirch Cedex, C.U. de Strasbourg, France Search for more papers by this author Thilo Riedl Thilo Riedl Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS/INSERM/ULP, B.P. 10142, 67404 Illkirch Cedex, C.U. de Strasbourg, France Search for more papers by this author Fumio Hanaoka Fumio Hanaoka Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 1–3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan Search for more papers by this author Jean-Marc Egly Corresponding Author Jean-Marc Egly Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS/INSERM/ULP, B.P. 10142, 67404 Illkirch Cedex, C.U. de Strasbourg, France Search for more papers by this author Author Information Thilo Riedl1, Fumio Hanaoka2 and Jean-Marc Egly 1 1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS/INSERM/ULP, B.P. 10142, 67404 Illkirch Cedex, C.U. de Strasbourg, France 2Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 1–3 Yamada-oka, Suita, Osaka, 565-0871 Japan *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2003)22:5293-5303https://doi.org/10.1093/emboj/cdg489 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info To understand the mechanism of nucleotide excision repair (NER), one of the major human DNA repair pathways, we have set up a DNA repair system in which a linear damaged DNA substrate is immobilized by its terminus. By isolating functionally active intermediate complexes, our data dissect the ordered arrival and displacement of NER factors in the progress of the dual incision step. We describe (i) the role of ATP in remodelling the NER-initiating complex of XPC/TFIIH/damaged DNA as a prerequisite for the recruitment of the next NER factors; (ii) the coordination between damage removal and DNA resynthesis and the release of XPC-HR23B, TFIIH and XPA upon arrival of XPG and XPF-ERCC1, respectively; (iii) how RPA remains associated with the excised DNA initiating the assembly of resynthesis factors such as PCNA; (iv) the recycling of XPC-HR23B, TFIIH and XPA in the NER; and the shuttling of TFIIH between NER and transcription. Thus, our findings define multiple functions of NER factors to explain the molecular basis of human NER disorders. Introduction Maintaining the integrity of the genome to allow proper cellular functioning is the objective of DNA repair pathways. The highly conserved nucleotide excision repair (NER) eliminates a broad variety of DNA lesions caused by UV light and chemical mutagens by two related subpathways (Lindahl and Wood, 1999). While the general global genome repair (GGR) removes DNA damage from the entire genome, the cell has set up a more specialized transcription-coupled repair (TCR) subpathway that corrects DNA lesions located on the actively transcribed strand (Mullenders and Berneburg, 2001). The biological consequences of NER defects are apparent from the inherited multisystem disorders xeroderma pigmentosum (XP), trichothiodystrophy (TTD) and Cockayne syndrome (CS) that are characterized by hyperphotosensitivity and a wide spectrum of neurodevelopmental abnormalities. XP patients show in addition a high incidence of UV-related skin cancers (reviewed in Berneburg and Lehmann, 2001). Following genotoxic attacks that block transcription and might result in cell cycle arrest (Zhou and Elledge, 2000), NER takes place after chromatin remodelling (Ura and Hayes, 2002) by eliminating a damage-containing oligomer (dual incision) and resynthesizing the excised DNA fragment (DNA resynthesis). In TCR, the elimination of the DNA damage is initiated by stalled RNA polymerase II (Mellon and Hanawalt, 1989), whereas in GGR the damage-induced DNA distortion is recognized by factors such as XPC-HR23B. In GGR, the six core NER factors XPC-HR23B, TFIIH, XPA, replication protein A (RPA), XPG and XPF-ERCC1 act in concert (Aboussekhra et al., 1995) to remove the damaged oligonucleotide, which spans 24 to 32 residues depending on the lesion and its surrounding sequences (Huang et al., 1992; Moggs et al., 1996). Although controversially discussed, it is now widely accepted that these NER factors assemble sequentially at sites of DNA damage (Guzder et al., 1996) rather than being recruited as a preformed repairosome complex (Svejstrup et al., 1995) or as part of the RNA pol II holoenzyme (Maldonado et al., 1996). While numerous in vitro studies have demonstrated potential roles in damage recognition not only for XPC-HR23B (Sugasawa et al., 1998), but also for XPA (Asahina et al., 1994), RPA (Reardon and Sancar, 2002) and a XPA–RPA complex (Wakasugi and Sancar, 1999), recent in vivo data support a model in which pre-incision complex formation is triggered by the binding of XPC-HR23B to the DNA damage (Volker et al., 2001). In a later step of NER, the XPB and XPD helicases of the transcription/repair factor TFIIH unwind the DNA around the lesion and provide an adequate substrate for the XPG and XPF-ERCC1 endonucleases (Evans et al., 1997), which cut the damaged DNA strand 3′ and 5′ to the lesion, respectively (O'Donovan et al., 1994; Sijbers et al., 1996). Subsequently, the gapped DNA is refilled by DNA Pol δ/ϵ, replication factor C (RFC), PCNA, RPA and DNA ligase I (Shivji et al., 1995). Attempts to investigate the sequential assembly of the dual incision complex in vitro and in vivo did neither document the functional relevance of observed complex intermediates nor reveal how the NER factors move upon damage removal to hand over the gapped DNA to the resynthesis machinery. In order to understand how gene expression can cope with the detrimental effects of DNA damage, we set up an elaborate system based on a mono-cisplatin-damaged DNA substrate immobilized on magnetic beads, which upon addition of selected NER factors allows investigation of the various phases of the dual incision reaction. We were able to determine the ATP-modulated sequential assembly of the NER factors resulting in active complex intermediates as well as the movement of the factors along the progress of the NER reaction including the targeting of the damaged DNA, the DNA opening and the recruitment of XPG and XPF-ERCC1 nucleases, which excise the damaged DNA fragment and finally allow the coordinated handing over to the subsequent DNA resynthesis step. Results ATP-independent initiation of NER by XPC-HR23B/TFIIH To characterize the various steps that direct the elimination of DNA damage, we designed an assay in which the DNA substrate containing a single cisplatin lesion is immobilized on magnetic beads and pre-incubated with either repair-competent HeLa nuclear extract (NE) or a reconstituted dual incision system (RIS) consisting of highly purified recombinant XPC-HR23B, TFIIH, XPA, RPA, XPG and XPF-ERCC1. In the absence of ATP no dual incision is observed (Figure 1A, lane 2). On the contrary, the addition of ATP mediates the binding of all the NER factors that participate to the incision/excision reaction as shown by the presence of radiolabelled 27–34 nt dual incision products (Figure 1A, lane 1). Figure 1.Binding of NER factors to damaged DNA. (A) Immobilized damaged DNA was pre-incubated with either NE or highly purified NER factors (RIS) in the presence (lane 1) or absence of ATP (lane 2) and aliquots were analysed for dual incision, which is indicated by radiolabelled 27 to 34-nt products. Proteins bound to the damaged DNA beads in the absence of ATP were analyzed by single NER factor omission in a reconstituted dual incision assay as indicated at the top (lanes 3–10). (B) Damaged DNA beads were pre-incubated with TFIIH and XPC-HR23B either alone or in combination. Proteins bound to the washed DNA beads were analyzed in a reconstituted dual incision assay lacking either XPC-HR23B (lanes 2, 5 and 8) or TFIIH (lanes 3, 6 and 9). Control reactions included the complete set of NER factors (lanes 1, 4 and 7). (C) Damaged DNA beads were pre-incubated with either NE or RIS in the presence of ATP at either 30 or 4°C and aliquots were analyzed for dual incision (lanes 1 and 2). DNA beads pre-incubated at 4°C were washed and subjected to dual incision assays lacking single NER factors (lanes 3–10). (D) Immobilized undamaged (−Pt) and damaged (+Pt) DNA was pre-incubated with NE (Load) either in the absence (lanes 2 and 3) or in the presence of ATP (lanes 4 and 5). Upon washing, DNA-bound proteins were analyzed by western blot (WB) using antibodies against indicated NER factors. Immobilized DNA was visualized by ethidium bromide staining (EtBr) after separation on agarose gel. Download figure Download PowerPoint To investigate which step of the reaction requires ATP, the cisplatinated DNA beads were first pre-incubated with either NE or RIS in the absence of ATP (Figure 1A, lanes 3–10). The immobilized DNA was subsequently rinsed with buffer containing 50 mM KCl and 0.02% NP40 to remove non-specifically bound proteins. The factors associated with the washed DNA beads were analyzed either functionally in a dual incision assay (Figure 1A, lanes 3–10) or by western blot (Figure 1D, lanes 1–3). When pre-incubated with NE in the absence of ATP, the cisplatinated DNA specifically retained XPC and TFIIH according to the detection of its XPD and p62 subunits, but no other NER factors (Figure 1D, lanes 2 and 3). When added to a complementation assay reconstituted with the purified NER factors (RIS), we observed that XPC(-HR23B) and TFIIH bound to the DNA beads participate in the incision reaction (Figure 1A, lanes 6 and 7). Using the RIS for the pre-incubation step, we additionally detected traces of XPA activity associated with the damaged DNA beads (Figure 1A, lower panel, lane 5), suggesting a possible interaction between XPA and the damage recognition complex XPC-HR23B–TFIIH (Nocentini et al., 1997). To discriminate which NER factor binds the DNA damage first, XPC-HR23B and TFIIH either alone or in combination were pre-incubated with the cisplatinated DNA beads in the absence of ATP. After washing, the adsorbed proteins were analyzed in a reconstituted dual incision assay that lacks either XPC-HR23B or TFIIH. Under these conditions, XPC-HR23B alone can bind the damaged DNA resulting in the NER complex 1 (NER-C1) (Figure 1B, lane 5). TFIIH does not interact with the damaged DNA unless XPC-HR23B is added (Figure 1B, lanes 3 and 9). Addition of ATP in the pre-incubation mixture did not enhance the XPC-HR23B–TFIIH binding (Figure 1D, lanes 3 and 5). The binding of XPC-HR23B and TFIIH resulting in the NER complex 2 (NER-C2) represents the initial step of NER that occurs independently of ATP. ATP-dependent recruitment of NER factors to damaged DNA The dual incision reaction is ATP-dependent (Figure 1A, lanes 1 and 2) and the XPB and XPD helicases of TFIIH require ATP to open the DNA around the lesion (Schaeffer et al., 1993; Evans et al., 1997). Thus, we wondered whether ATP mediates the arrival of additional NER factors to NER-C2. We pre-incubated the immobilized damaged DNA together with either HeLa NE or RIS in the presence of ATP at 4°C so as to prevent DNA incision by XPG and XPF-ERCC1 nucleases (Figure 1C, lanes 1 and 2) (Wakasugi and Sancar, 1998). Following a washing step, the NER factors associated with NER-C2 were analyzed (Figure 1C and D). Under these conditions (+ ATP), all the NER factors including XPC-HR23B, TFIIH, XPA, RPA, XPG and XPF-ERCC1 are present on the cisplatinated DNA beads (Figure 1D, lane 5) and all of them, except RPA, are active in dual incision (Figure 1C, lanes 5–10). Remarkably, although two of the three RPA subunits are found associated with the damaged DNA when ATP is present (Figure 1D, lane 5), its activity was not detected (Figure 1C, lane 8). However, we cannot exclude that this is due to the lack of the third RPA14 subunit that could not be analyzed by western blot, because we failed to generate a corresponding antibody. Addition of recombinant RPA to the characterized damaged DNA–protein complex restored the incision reaction (data not shown). Importantly, the omission of XPC-HR23B from pre-incubations in the presence of ATP completely abolished the binding of any NER factor (data not shown). Sequential arrival of NER factors to the pre-incision complex We then investigated the chronological order of ATP-dependent XPA, RPA, XPG and XPF-ERCC1 recruitment to the NER-C2 containing both XPC-HR23B and TFIIH. The pre-assembled and washed NER-C2 was pre-incubated in the presence or absence of ATP with different combinations of XPA, RPA, XPG and XPF-ERCC1 (Figure 2A) as indicated at the left of Figure 2B. Following a second wash (2nd wash), the resulting complexes were analyzed by factor omission in a dual incision reaction (Figure 2B). Figure 2.Sequential arrival of NER factors to the pre-incision complex. (A) NER-C2 was assembled on immobilized damaged DNA by incubation with XPC-HR23B and TFIIH in the absence of ATP, washed, and pre-incubated with different combinations of XPA, RPA, XPG and XPF-ERCC1 in the presence (+ATP) or absence of ATP (−ATP). After a second wash (2nd wash) aliquots were analyzed in dual incision assays. (B) Immobilized NER-C2 was pre-incubated with NER factors indicated in the left of the figure in the presence (lanes 1–6) or absence of ATP (lanes 7–12). The resulting complexes were tested in a dual incision reaction lacking one of the NER factors as indicated at the top. (C) NER-C2 was pre-incubated in the presence of ATP with combinations of XPA, RPA and XPG as indicated. Upon washing, bound XPG (lanes 1 and 2) and XPA (lanes 3–6) activity was analyzed in a dual incision assay. The quantification by phosphorimager (lower panel) was normalized to lanes 2 and 3, respectively. Download figure Download PowerPoint First, none of the four additional NER factors significantly bound the preformed NER-C2 in the absence of ATP (Figure 2B, panels I–V, lanes 9–12). When pre-incubated together in the presence of ATP, all of them, except RPA, associated with NER-C2 to participate in the dual incision reaction (Figure 2B, panel I, lanes 3–6). As demonstrated above, although we did not detect RPA activity (Figure 2B, lane 4), it might be present in the complexes. Secondly, the removal of XPA from the pre-incubation completely abolished the binding of any additional factor to NER-C2 (Figure 2B, panel II), suggesting that association of XPA with NER-C2 results in the subsequent NER-C3 complex. Thirdly, in the absence of RPA, XPF-ERCC1 could not join the preformed NER-C2, whereas XPG (as well as XPA) still bound to the damaged DNA (Figure 2B, panel III, compare lane 3 with 9 and lane 5 with 11, respectively). To define the role of RPA in the incision reaction, we analyzed quantitatively the effect of RPA on XPG (and XPA) binding. In these experiments, RPA was pre-incubated together with XPG in the presence of NER-C2 and XPA (Figure 2C). After the second wash, the resulting nucleoprotein complexes were tested in a dual incision assay in which either XPG or XPA were omitted (Figure 2C, left and right panels). Although RPA is not required for the binding of XPG to NER-C3 (Figure 2B, panel III), its presence strongly conditions the association of XPG to the dual incision complex (Figure 2C, lanes 1 and 2); therefore RPA forms the NER-C4 complex. We however noticed that when added together, XPA, RPA and XPG mutually stabilize on the NER-C2 (Figure 2C, lanes 3–5). Fourthly, in the absence of XPG, XPF-ERCC1 could not bind to the damaged DNA (Figure 2B, panel IV, lane 6). On the contrary, the removal of XPF-ERCC1 from pre-incubation still allows XPG binding to form the NER-C5 (Figure 2B, panel V, lane 5). Thus, XPF-ERCC1 is the last factor arriving to the DNA damage resulting in the mature pre-incision complex NER-C6. The movement of NER factors upon dual incision To investigate which NER factors might remain associated with the DNA once the damaged oligonucleotide is excised, we incubated the immobilized cisplatinated DNA with HeLa NE and analyzed over time the progress of the NER reaction (Figure 3A) as well as the NER factors bound to the DNA beads (Figure 3B). Some reactions were performed at 4°C to prevent DNA incision by XPG/XPF-ERCC1. Figure 3.Progress of the dual incision reaction. (A) Immobilized damaged DNA was incubated with NE in the presence of ATP either at 4 or 30°C and aliquots were analyzed over time for NER as illustrated on both sides of the figure. Dual incision was monitored as in preceding experiments. Southern blot (SB) membrane was probed with either a 24-nt radiolabelled oligonucleotide complementary to the cisplatin damage (Pt-sites) or a 24-nt oligonucleotide corresponding to the excised damaged DNA patch (undamaged strand). Resynthesis is indicated by a radiolabelled 94-nt product. For resynthesis, the DNA polymerases δ/ϵ inhibitor aphidicolin was deprived from reactions. Quantification was performed on a phosphorimager (Relative Scanning Units, RSU1 − 4). Data were normalized either to lane 8 (RSU1+4) or to lane 1 (RSU2+3), respectively. (B) Undamaged (−Pt) and damaged (+Pt) DNA beads were incubated with NE (Load) in the presence of ATP at either 4 or 30°C for 40 and 120 min, respectively. DNA bound proteins were analyzed after washing by western blot. The experiment has been repeated four times. Download figure Download PowerPoint Monitoring over time the dual incision, we found a maximum of the excision product after 40 min of incubation at 30°C (Figure 3A, upper panel, lane 4). We further investigated the removal of platin sites (Pt-sites) from the damaged DNA by Southern blot (Figure 3A, middle panels) probing the DNA substrate either with an oligonucleotide complementary to the excised damaged DNA fragment to reveal the remaining Pt-sites on the DNA (Figure 3A, middle panel, Pt-sites) or with an oligonucleotide corresponding to the excised damaged DNA to quantify the undamaged strand (Figure 3A, middle panel, undamaged strand). After 40 min of incubation at 30°C, only a small portion of Pt-sites have been removed from the DNA (Figure 3A, Pt-sites, lane 4: 10%), whereas after 120 min the majority (up to 70%) of damage sites have been eliminated (Figure 3A, Pt-sites, lane 8). In correlation with this, we also found an increase of resynthesis of the excised damaged DNA fragment up to 120 min of incubation when DNA polymerase δ/ϵ inhibitor aphidicolin was deprived from the reaction (Figure 3A, lower panel). Remarkably, both kinetics illustrating the damage removal and the DNA resynthesis present the same slope, suggesting coordination between these two steps of the NER reaction. The observed difference in the progress of damage removal when quantifying either the excised damaged DNA fragment (Figure 3A, upper panel, dual incision) or the amount of remaining Pt-sites on the substrate (Figure 3A, middle panel, Pt-sites) most likely reflects a concomitant degradation of the excised DNA fragment being released to the supernatant (Figure 4A, lanes 1–3) by nucleases present in the NE. Figure 4.Characterization of excised damaged DNA fragments. (A) Immobilized damaged DNA was incubated with NE or RIS and aliquots were analyzed for dual incision products either directly (lanes 1 and 4) or after separating DNA beads (lanes 2 and 5) from the corresponding supernatants (lanes 3 and 6). (B) Immobilized NER-C2 was incubated with RIS and the supernatant (SN/Load) was separated from the damaged DNA beads and loaded either directly (supernatant) or after phenol–chloroform extraction (Phenol/CHCl3 extracted) on a gel filtration column. The collected fractions were analyzed for dual incision products. The elution of catalase (232 kDa), aldolase (158 kDa), ovalbumin (43 kDa) and myoglobin (17 kDa) as markers is indicated. Download figure Download PowerPoint In parallel to the excision of the damaged oligonucleotide (Figure 3A, middle panel, Pt-sites), most of the factors that were present in the readily assembled NER complex when pre-incubated at 4°C (Figure 3B, lanes 3 and 7) progressively leave the immobilized DNA after 40 and 120 min, once dual incision takes place at 30°C (Figure 3B, lanes 5 and 9). RPA known to be involved in the resynthesis step (Shivji et al., 1995) was the only NER factor that remained stably associated with the incised DNA even after 120 min of incubation at 30°C (Figure 3B, lanes 3, 5 and 9). Correlated with the removal of the damage, we also observed an accumulation of PCNA on the formerly cisplatinated DNA (Figure 3B, lanes 5 and 9). The excised damaged DNA fragment is free of NER factors Having observed the release of NER factors upon dual incision, we asked whether any of these factors might be associated with the excised damaged DNA fragment. Following the dual incision by either HeLa NE or RIS, the immobilized DNA was separated from the soluble supernatant and the excised damaged oligonucleotides from both fractions were end-labelled. In each case, most (90 and 70%, respectively) of the excised damaged DNA fragment was found in the supernatant (SN) (Figure 4A, lanes 3 and 6) demonstrating that the minimal set of NER factors (RIS) is sufficient to promote not only dual incision, but also excision (the release) of the damaged DNA fragment. When the soluble supernatant of a RIS reaction was loaded on a gel filtration column, the excised damaged DNA detected by post-column end-labelling eluted with a retention volume corresponding to 20 kDa (Figure 4B, upper panel). This excised DNA fragment was protein-free, since phenol chloroform extraction of the supernatant before loading did not shift the retention volume (Figure 4B, lower panel). Release of XPC-HR23B and TFIIH from the NER complex To analyze the movement of XPC-HR23B and TFIIH along the dual incision reaction, immobilized NER-C2 was pre-incubated in the presence of ATP with combinations of XPA, RPA, XPG and XPF-ERCC1 as indicated at the top of Figure 5B. Supernatants were then separated from the damaged DNA beads and analyzed for the presence of XPC-HR23B and/or TFIIH either in a dual incision reaction using a second damaged DNA substrate Pt(II) or in a reconstituted transcription assay (Figure 5A). Figure 5.Release of XPC-HR23B and TFIIH; shuttling of TFIIH. (A) NER-C2 immobilized on damaged DNA Pt(I) was pre-incubated in the presence of ATP with indicated NER factors. Resulting supernatants were separated from DNA beads and tested for XPC-HR23B and TFIIH activity in a dual incision assay using damaged DNA substrate Pt(II) and saturating amounts of NER factors (RIS). The use of damaged DNA Pt(II) prevents interference of dual incision products. TFIIH release was additionally monitored by its omission in a basal transcription assay with a DNA template containing the AdMLP (Gerard et al., 1991). (B) Supernatants obtained by pre-incubating NER-C2 with indicated NER proteins were analyzed either by dual incision assays in which XPC-HR23B (top panel) or TFIIH (middle panel) were omitted or in a basal transcription assay with a 309-nt run-off product (lower panel). Control reactions contained the complete set of NER or transcription factors (lane 1), no NER or transcription factors (lane 2) or were lacking only either XPC-HR23B or TFIIH (negative, lane 3). Quantifications by phosphorimager (RSU) were normalized to lane 4. (C) Washed pre-initiation complexes were assembled on immobilized AdMLP DNA template with purified transcription factors. Transcription was then initiated by the addition of rNTPs in the presence of damaged DNA and NER factors lacking TFIIH (lanes 1 and 2). When indicated, rNTPs were substituted by ATP (lanes 3 and 4) and/or RNA pol II inhibitor α-amanitin was added (lanes 2 and 4). The transcription run-off product (563 nt) and dual incision of damaged DNA (27–34 nt) were monitored. The experiment has been reproduced five times using various transcription templates. Download figure Download PowerPoint Although pre-incubation of NER-C2 with XPA either alone or in combination with RPA did not promote the release of XPC-HR23B and TFIIH to the supernatant (Figure 5B, upper panel, compare lanes 5 and 6 with lane 4), the pre-incubation of NER-C2 together with XPA, RPA and XPG resulting in NER-C5 significantly increased (2.6×) the release of XPC-HR23B (Figure 5B, lane 7). Moreover, further addition of XPF-ERCC1, which generates the NER-C6 and allows dual incision, directed the release (2.7×) of TFIIH (Figure 5B, middle panel, lane 8). These data suggest that (i) XPC-HR23B leaves the premature NER-C5 upon XPG arrival; (ii) although XPC-HR23B mediates TFIIH association with the damaged DNA, it is not required to maintain TFIIH in a higher-order complex until XPF-ERCC1 arrival; and (iii) the released XPC-HR23B and TFIIH are still active in NER. TFIIH shuttles between transcription and DNA repair In addition to its role in NER, TFIIH is an essential factor in RNA pol II transcription (Gerard et al., 1991). Therefore we investigated whether TFIIH is able to shuttle between NER and transcription. We observed that TFIIH released from the dual incision complex by pre-incubating NER-C2 together with XPA, RPA, XPG and XPF-ERCC1 substantially (6.2×) supports RNA synthesis when added in a reconstituted transcription assay containing in addition to an adenovirus major late promoter (AdMLP) template, RNA pol II, TFIIA, TFIIB, TBP, TFIIE and TFIIF transcription factors (Figure 5B, lower panel, lane 8); demonstrating that TFIIH having been involved in the NER reaction can subsequently participate in RNA pol II transcription. Knowing that TFIIH incorporated in RNA pol II pre-initiation complexes is released from the DNA template while RNA pol II enters the elongation phase (Zawel et al., 1995; Spangler et al., 2001), we investigated whether such a released TFIIH might subsequently participate in the removal of DNA damage. Purified pre-initiation complexes were generated by pre-incubation of immobilized AdMLP transcription template with RNA pol II and the basal transcription factors and subsequent washing with a buffer containing 50 mM KCl and 0.05% sarkosyl to remove non-specifically bound proteins. The transcription pre-initiation complexes were then incubated in the presence of all four rNTPs together with a damaged DNA substrate and the purified NER factors (RIS) except TFIIH. When indicated (Figure 5C), the transcription inhibitor α-amanitin was added and/or rNTPs were substituted by ATP. Occurrence of RNA synthesis promotes the release of TFIIH that further participates in dual incision (Figure 5C, lane 1). On the contrary, addition of the α-amanitin transcription inhibitor prevents transcription, the release of TFIIH, and consequently its participation in dual incision (Figure 5C, lane 2). α-Amanitin per se did not inhibit the dual incision reaction (Figure 5C, lanes 3 and 4). Together our data demonstrate that in purified systems TFIIH is able to switch from transcription to DNA repair and vice versa. The release of XPA and XPG from dual incision complexes was analyzed by pre-incubating the immobilized and purified NER-C5 complex was pre-incubated in the presence of ATP with XPF/ERCC1 either alone or in combination with XPG and RPA in excess as indicated at the top of Figure 6B. Similar to the scheme in Figure 5A, supernatants were then separated and analyzed in dual incision reactions lacking XPA. Pre-incubation of NER-C5 with RPA or XPG either alone or in combination did not promote XPA release to the supernatant (Figure 6B, lanes 4, 5 and 7). On the contrary, addition of XPF-ERCC1 was sufficient to promote the release of XPA from NER-C5 and its participation in a subsequent dual incision reaction (Figure 6B, lane 6). The release of XPA was even increased when RPA was added to pre-incubation with XPF/ERCC1 (Figure 6B, lanes 8 and 9), possibly highlighting the role of RPA as the relay for further NER steps. Figure 6.Release of XPA and XPG. (A) Experimental design of NER substrate challenge assays. NER-C5 was pre-assembled by incubating immobilized DNA Pt(I) with purified XPC-HR23B, TFIIH, XPA, RPA and XPG in the presence of ATP. Washed NER-C5 complexes were pre-incubated for 10 min in the presence of ATP with XPC-HR23B, TFIIH, RPA and either XPG (for C) or XPA (for E). Pre-incubations included either challenge DNA Pt(II) or undamaged DNA. After pre-incubation, XPF-ERCC1 was added to the reaction and dual incision of both substrates Pt(I) and Pt(II) was monitored over time. (B) Washed NER-C5 was pre-incubated in the presence of ATP with the indicated combinations of NER factors (top of the figures). Resulting supernatants were separated from DNA beads and analyzed by omitting XPA in a dual incision assay with DNA Pt(II). (C) Substrate challenge assay: XPA release. Dual incision products were resolved on denaturing polyacrylamide gels and quantified by phosphorimager. Data were normalized to the dual incision of Pt(I) substrate measured after 40 min incubation in the presence of undamaged competitor

A mammalian nucleotide excision repair (NER) factor, the XPC–HR23B complex, can specifically bind to certain DNA lesions and initiate the cell-free repair reaction. Here we describe a detailed analysis of its binding specificity using various DNA substrates, each containing a single defined lesion. A highly sensitive gel mobility shift assay revealed that XPC–HR23B specifically binds a small bubble structure with or without damaged bases, whereas dual incision takes place only when damage is present in the bubble. This is evidence that damage recognition for NER is accomplished through at least two steps; XPC–HR23B first binds to a site that has a DNA helix distortion, and then the presence of injured bases is verified prior to dual incision. Cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) were hardly recognized by XPC–HR23B, suggesting that additional factors may be required for CPD recognition. Although the presence of mismatched bases opposite a CPD potentiated XPC–HR23B binding, probably due to enhancement of the helix distortion, cell-free excision of such compound lesions was much more efficient than expected from the observed affinity for XPC–HR23B. This also suggests that additional factors and steps are required for the recognition of some types of lesions. A multistep mechanism of this sort may provide a molecular basis for ensuring the high level of damage discrimination that is required for global genomic NER.

The DDB1-CUL4-RBX1 (CRL4) ubiquitin ligase family regulates a diverse set of cellular pathways through dedicated substrate receptors (DCAFs). The DCAF DDB2 detects UV-induced pyrimidine dimers in the genome and facilitates nucleotide excision repair. We provide the molecular basis for DDB2 receptor-mediated cyclobutane pyrimidine dimer recognition in chromatin. The structures of the fully assembled DDB1-DDB2-CUL4A/B-RBX1 (CRL4(DDB2)) ligases reveal that the mobility of the ligase arm creates a defined ubiquitination zone around the damage, which precludes direct ligase activation by DNA lesions. Instead, the COP9 signalosome (CSN) mediates the CRL4(DDB2) inhibition in a CSN5 independent, nonenzymatic, fashion. In turn, CSN inhibition is relieved upon DNA damage binding to the DDB2 module within CSN-CRL4(DDB2). The Cockayne syndrome A DCAF complex crystal structure shows that CRL4(DCAF(WD40)) ligases share common architectural features. Our data support a general mechanism of ligase activation, which is induced by CSN displacement from CRL4(DCAF) on substrate binding to the DCAF.

The variant form of the human syndrome xeroderma pigmentosum (XPV) is caused by a deficiency in DNA polymerase eta (Poleta), a DNA polymerase that enables replication through ultraviolet-induced pyrimidine dimers. Here we report high-resolution crystal structures of human Poleta at four consecutive steps during DNA synthesis through cis-syn cyclobutane thymine dimers. Poleta acts like a 'molecular splint' to stabilize damaged DNA in a normal B-form conformation. An enlarged active site accommodates the thymine dimer with excellent stereochemistry for two-metal ion catalysis. Two residues conserved among Poleta orthologues form specific hydrogen bonds with the lesion and the incoming nucleotide to assist translesion synthesis. On the basis of the structures, eight Poleta missense mutations causing XPV can be rationalized as undermining the molecular splint or perturbing the active-site alignment. The structures also provide an insight into the role of Poleta in replicating through D loop and DNA fragile sites.