The association of mutant forms of Ras protein with a variety of human cancers has stimulated intense interest in therapies based on inhibiting oncogenic Ras signaling. Attachment of Ras proteins to the plasma membrane is required for effective Ras signaling and is initiated by the enzyme farnesyl protein transferase. We found that in the presence of potent farnesyl protein transferase inhibitors, Ras proteins in the human colon carcinoma cell line DLD-1 were alternatively prenylated by geranylgeranyl transferase-1. When H-Ras, N-Ras, K-Ras4A, and K-Ras4B were expressed individually in COS cells, H-Ras prenylation and membrane association were found to be uniquely sensitive to farnesyl transferase inhibitors; N- and K-Ras proteins incorporated the geranylgeranyl isoprene group and remained associated with the membrane fraction. The alternative prenylation of N- and K-Ras has significant implications for our understanding of the mechanism of action of farnesyl protein transferase inhibitors as anti-cancer chemotherapeutics.

Abstract Purpose: Tumor genotyping using cell-free plasma DNA (cfDNA) has the potential to allow noninvasive assessment of tumor biology, yet many existing assays are cumbersome and vulnerable to false-positive results. We sought to determine whether droplet digital PCR (ddPCR) of cfDNA would allow highly specific and quantitative assessment of tumor genotype. Experimental Design: ddPCR assays for EGFR, KRAS, and BRAF mutations were developed using plasma collected from patients with advanced lung cancer or melanoma of a known tumor genotype. Sensitivity and specificity were determined using cancers with nonoverlapping genotypes as positive and negative controls. Serial assessment of response and resistance was studied in patients with EGFR-mutant lung cancer on a prospective trial of erlotinib. Results: We identified a reference range for EGFR L858R and exon 19 deletions in specimens from KRAS-mutant lung cancer, allowing identification of candidate thresholds with high sensitivity and 100% specificity. Received operative characteristic curve analysis of four assays demonstrated an area under the curve in the range of 0.80 to 0.94. Sensitivity improved in specimens with optimal cfDNA concentrations. Serial plasma genotyping of EGFR-mutant lung cancer on erlotinib demonstrated pretreatment detection of EGFR mutations, complete plasma response in most cases, and increasing levels of EGFR T790M emerging before objective progression. Conclusions: Noninvasive genotyping of cfDNA using ddPCR demonstrates assay qualities that could allow effective translation into a clinical diagnostic. Serial quantification of plasma genotype allows noninvasive assessment of response and resistance, including detection of resistance mutations up to 16 weeks before radiographic progression. Clin Cancer Res; 20(6); 1698–705. ©2014 AACR.

Abstract The high frequency of activating RAS or BRAF mutations in cancer provides strong rationale for targeting the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway. Selective BRAF and MAP-ERK kinase (MEK) inhibitors have shown clinical efficacy in patients with melanoma. However, the majority of responses are transient, and resistance is often associated with pathway reactivation of the extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway. Here, we describe the identification and characterization of SCH772984, a novel and selective inhibitor of ERK1/2 that displays behaviors of both type I and type II kinase inhibitors. SCH772984 has nanomolar cellular potency in tumor cells with mutations in BRAF, NRAS, or KRAS and induces tumor regressions in xenograft models at tolerated doses. Importantly, SCH772984 effectively inhibited MAPK signaling and cell proliferation in BRAF or MEK inhibitor–resistant models as well as in tumor cells resistant to concurrent treatment with BRAF and MEK inhibitors. These data support the clinical development of ERK inhibitors for tumors refractory to MAPK inhibitors. Significance: BRAF and MEK inhibitors have activity in MAPK-dependent cancers with BRAF or RAS mutations. However, resistance is associated with pathway alterations resulting in phospho-ERK reactivation. Here, we describe a novel ERK1/2 kinase inhibitor that has antitumor activity in MAPK inhibitor-naïve and MAPK inhibitor-resistant cells containing BRAF or RAS mutations. Cancer Discov; 3(7); 742–50. ©2013 AACR. See related commentary by Nissan et al., p. 719 This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 705

Survivin is an inhibitor of apoptosis protein, which is over-expressed in most tumors. Aberrant expression of survivin and loss of wild-type p53 in many tumors prompted us to investigate a possible link between these two events. Here we show that wild-type p53 represses survivin expression at both mRNA and protein levels. Transient transfection analyses revealed that the expression of wild-type p53, but not mutant p53, was associated with strong repression of the survivin promoter in various cell types. The over-expression of exogenous survivin protein rescues cells from p53-induced apoptosis in a dose-dependent manner, suggesting that loss of survivin mediates, at least, in part the p53-dependent apoptotic pathway. In spite of the presence of two putative p53-binding sites in the survivin promoter, deletion and mutation analyses suggested that neither site is required for transcriptional repression of survivin expression. This was confirmed by chromatin immunoprecipitation assays. Further analyses suggested that the modification of chromatin within the survivin promoter could be a molecular explanation for silencing of survivin gene transcription by p53.

We have generated a series of rat fibroblast cell lines that stably overexpress a full-length cDNA encoding the beta 1 form of protein kinase C (PKC). These cell lines contain a 20- to 53-fold increase in PKC activity and exhibit dramatically enhanced morphologic changes following exposure to the tumor promoter 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA). They grow to a high saturation density in monolayer cultures and, when maintained at postconfluence, develop small, dense foci. In contrast to control cells, which display complete anchorage dependence, PKC-overproducing cells form small colonies in soft agar in the absence of TPA and large colonies in the presence of TPA. Thus, the mere overproduction of a single form of PKC is sufficient to confer multiple growth abnormalities in rat fibroblasts. These results provide direct evidence that PKC plays a critical role in growth control and that it mediates several of the cellular effects of the phorbol ester tumor promoters. They also suggest that the activation of PKC may be of central importance in the process of multistage carcinogenesis.

Abstract Cyclin-dependent kinases (CDK) are key positive regulators of cell cycle progression and attractive targets in oncology. SCH 727965 inhibits CDK2, CDK5, CDK1, and CDK9 activity in vitro with IC50 values of 1, 1, 3, and 4 nmol/L, respectively. SCH 727965 was selected as a clinical candidate using a functional screen in vivo that integrated both efficacy and safety parameters. Compared with flavopiridol, SCH 727965 exhibits superior activity with an improved therapeutic index. In cell-based assays, SCH 727965 completely suppressed retinoblastoma phosphorylation, which correlated with apoptosis onset and total inhibition of bromodeoxyuridine incorporation in >100 tumor cell lines of diverse origin and background. Moreover, short exposures to SCH 727965 were sufficient for long-lasting cellular effects. SCH 727965 induced regression of established solid tumors in a range of mouse models following intermittent scheduling of doses below the maximally tolerated level. This was associated with modulation of pharmacodynamic biomarkers in skin punch biopsies and rapidly reversible, mechanism-based effects on hematologic parameters. These results suggest that SCH 727965 is a potent and selective CDK inhibitor and a novel cytotoxic agent. Mol Cancer Ther; 9(8); 2344–53. ©2010 AACR.

Abstract Ex vivo systems that incorporate features of the tumor microenvironment and model the dynamic response to immune checkpoint blockade (ICB) may facilitate efforts in precision immuno-oncology and the development of effective combination therapies. Here, we demonstrate the ability to interrogate ex vivo response to ICB using murine- and patient-derived organotypic tumor spheroids (MDOTS/PDOTS). MDOTS/PDOTS isolated from mouse and human tumors retain autologous lymphoid and myeloid cell populations and respond to ICB in short-term three-dimensional microfluidic culture. Response and resistance to ICB was recapitulated using MDOTS derived from established immunocompetent mouse tumor models. MDOTS profiling demonstrated that TBK1/IKKϵ inhibition enhanced response to PD-1 blockade, which effectively predicted tumor response in vivo. Systematic profiling of secreted cytokines in PDOTS captured key features associated with response and resistance to PD-1 blockade. Thus, MDOTS/PDOTS profiling represents a novel platform to evaluate ICB using established murine models as well as clinically relevant patient specimens. Significance: Resistance to PD-1 blockade remains a challenge for many patients, and biomarkers to guide treatment are lacking. Here, we demonstrate feasibility of ex vivo profiling of PD-1 blockade to interrogate the tumor immune microenvironment, develop therapeutic combinations, and facilitate precision immuno-oncology efforts. Cancer Discov; 8(2); 196–215. ©2017 AACR. See related commentary by Balko and Sosman, p. 143. See related article by Deng et al., p. 216. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 127

Abstract KRAS-driven lung cancers frequently inactivate TP53 and/or STK11/LKB1, defining tumor subclasses with emerging clinical relevance. Specifically, KRAS-LKB1 (KL)–mutant lung cancers are particularly aggressive, lack PD-L1, and respond poorly to immune checkpoint blockade (ICB). The mechanistic basis for this impaired immunogenicity, despite the overall high mutational load of KRAS-mutant lung cancers, remains obscure. Here, we report that LKB1 loss results in marked silencing of stimulator of interferon genes (STING) expression and insensitivity to cytoplasmic double-strand DNA (dsDNA) sensing. This effect is mediated at least in part by hyperactivation of DNMT1 and EZH2 activity related to elevated S-adenylmethionine levels and reinforced by DNMT1 upregulation. Ectopic expression of STING in KL cells engages IRF3 and STAT1 signaling downstream of TBK1 and impairs cellular fitness, due to the pathologic accumulation of cytoplasmic mitochondrial dsDNA associated with mitochondrial dysfunction. Thus, silencing of STING avoids these negative consequences of LKB1 inactivation, while facilitating immune escape. Significance: Oncogenic KRAS-mutant lung cancers remain treatment-refractory and are resistant to ICB in the setting of LKB1 loss. These results begin to uncover the key underlying mechanism and identify strategies to restore STING expression, with important therapeutic implications because mitochondrial dysfunction is an obligate component of this tumor subtype. See related commentary by Corte and Byers, p. 16. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 1