With the indirect immunofluorescence technique of Coons and collaborators a possible coexistence of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and substance P in neurons of the lower medulla oblongata was explored. Antisera to 5-HT and to dopadecarboxylase (aromaticl-aminoacid decarboxylase), an enzyme probably present in immunologically indistinguishable forms both in catecholamine and 5-HT neurons, were used as markers for 5-HT neurons and an antiserum raised to synthetic substance P conjugated with bovine serum albumin for substance P-containing neurons. Five or 10 μm thick, consecutive sections were stained with the three antisera. Numerous cell somata in nucleus raphe magnus, nucleus raphe obscurus, nucleus raphe pallidus, pars α of the nucleus reticularis gigantocellularis and nucleus interfascicularis hypoglossi contained both substance P-like immunoreactivity and 5-HT (and dopadecarboxylase) immunoreactive material. After intraventricular or intracisternal injections of 5,6- or 5,7-dihydroxytryptamine, two neurotoxins assumed to cause degeneration mainly of 5-HT neurons, enlarged substance P and 5-HT (and dopadecarboxylase) positive fibres were seen in, around and lateral to the olivary complex. Furthermore, in these rats both substance P and 5-HT positive nerve terminals in the ventral horns of the spinal cord disappeared. These findings indicate that substance P and 5-HT may coexist not only in some cell bodies but also in axons and nerve endings. The latter conclusion must, however, remain tentative since the neurotoxins may cause unspecific damage and thus not only damage 5-HT (and postulated 'SP-5-HT') neurons. In further experiments reserpine was used, a drug known to deplete monoamines by affecting their storage sites. With a high dose of reserpine a marked depletion of 5-HT was obtained both in nerve terminals and cell bodies whereas substance P immunoreactive material seemed unaffected. Possible interpretations of these findings is that substance P and 5-HT have different storage sites within the neuron, or that reserpine selectively causes loss of 5-HT and not substance P from the same storage site.

Using indirect immunofluorescence histochemistry, in part combined with the elution and restaining technique of Tramu et al., 1978 Tramu G. Pillez A. Leonardelli J. An efficient method of antibody elution for the successive or simultaneous localization of two antigens by immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 1978; 26: 322-324 Crossref PubMed Google Scholar , the distribution of 5-hydroxytryptamine (5-HT), thyrotropin releasing hormone (TRH) and substance P immunoreactive neurons has been studied in the medulla oblongata and spinal cord of normal and colchicine-treated rats. Evidence was obtained that at least some cell bodies in the medullary raphe nuclei and adjacent areas contained all three compounds, 5-HT, TRH and substance P. Other cell bodies in the same areas may contain two or only one of these three putative transmitters. Alternatively, the intraneuronal levels of one or two of the substances may be too low to be detected with the present technique, in spite of the fact that colchicine treatment was used to elevate peptide levels in the cell somata. In a quantitative evaluation the proportion of 5-HT, TRH and substance P neurons was calculated at different levels and in different nuclei of the medulla oblongata. Out of all immunoreactive neurons, there were approximately twice as many 5-HT (56%) as TRH (23%) and substance P (21%) cells respectively, and this relation was also found in several major subnuclei, such as the nucleus raphe magnus and nucleus raphe obscurus. In the 'arcuate' region very high proportions of 5-HT cells (about 60–80%) were observed with only few substance P cells (2–12%). The 'parapyramidal' and 'paraolivar' regions, which include the nucleus interfascicularis hypoglossi, had more substance P (26–36%) than TRH (15–17%) cells. The most 'even' distribution was observed in the nucleus raphe pallidus (5-HT: 43%; TRH: 32%; substance P: 25%). The evaluation also indicated how the respective cell type (5-HT, TRH and substance P cells) distributed between the different subnuclei. Thus, at rostral levels the 'suprapyramidal' region contained a large proportion (about 30%) of the total numbers of counted 5-HT, TRH and substance P cells, respectively. Furthermore, the nucleus raphe magnus contained a large part (about 30%) of the TRH and substance P cells, but a smaller fraction (about 20%) of the 5-HT cells. Analysis of adjacent sections at regular intervals confirmed the overall quantitative evaluation. Generally, the distribution of 5-HT, TRH and substance P cells were roughly parallel. An exception was the midportion of the rostral medulla oblongata, where 5-HT cells were very numerous. Of particular interest was the fact that, especially in the nucleus raphe pallidus, there were in several series almost the same number of 5-HT, TRH and substance P cells, supporting the view that many cells in this nucleus contained all these compounds. In the spinal cord overlapping networks of 5-HT, TRH and substance P immunoreactive fibres were observed in the ventral horn. The number of 5-HT immunoreactive fibres seemed higher than the TRH and substance P immunoreactive ones. After treatment with the neurotoxins 5,6- or 5,7-dihydroxytryptamine there was an almost complete disappearance of all three types of fibres in the ventral horn, further supporting the occurrence of the two peptides in 5-HT neurons, either both of them together in the same 5-HT neuron or each of them in separate 5-HT neurons. It is, however, important to note that there are, in all probability, 5-HT neurons in the lower medulla oblongata which contain neither TRH nor substance P. Furthermore, in other brain regions there is no certain correlation between the distribution patterns of 5-HT, TRH and substance P immunoreactive cells. The results are consistent with the coexistence of 5-HT, TRH and substance P in neurons of the medulla oblongata that project to the spinal cord. Some neurons may contain detectable levels only of 5-HT and substance P, others only of 5-HT and TRH, while others contain all three substances. It can, however, not be excluded that some neurons contain only one of these compounds or that other combinations exist.

A detailed description is given of an immunohistochemical technique for the localization of serotonin in the central nervous system of the rat. In rabbits antibodies were raised against an antigen prepared by coupling serotonin to bovine serum albumin using formaldehyde as a coupling reagent. In the antisera two types of antibodies, one against the bovine serum albumin-serotonin complex and another type directed to bovine serum albumin were demonstrated by immunoelectrophoresis. The antibodies to serum albumin could be removed by affinity chromatography. Brains and spinal cords of rats were fixed by perfusion with ice-cold 4% formaldehyde in 0.1m-sodium phosphate buffer (pH 7.3) and sectioned on a cryostat. The sections were stained by the indirect immunofluorescence technique. Immunofluorescence specific for serotonin was observed in cell bodies and fibre systems. The antisera could be diluted up to 1:1024 provided a prolonged incubation at 4°C was employed. The specificity of the antisera was examined by inhibition tests. From these tests it was estimated that in the central nervous system of the rat there might be a cross-reactivity of approximately 2% to 5-methoxytryptamine and dopamine and less than 1% to noradrenaline and adrenaline under the conditions which were used. Thus the procedure appears to be a specific and sensitive technique for the localization of serotonin in the central nervous system; it has the advantage that adjacent sections can be examined by the immunofluorescence method using antisera to a variety of antigens. The application of this technique is some parts of the brain and spinal cord of the rat is demonstrated.

The coexistence of galanin (GAL)-like immunoreactivity (LI) with markers for catecholamines, 5-hydroxytryptamine (5-HT), GABA, or some neuropeptides was mapped in the rat CNS by using adjacent sections, as well as by elution-restaining and double-labeling immunocytochemistry. Many instances of coexistence were observed, but there were also numerous GAL-positive cell body populations displaying distributions similar to those of these markers but without apparent coexistence. In the hypothalamic arcuate nucleus GAL-LI was found in a large proportion of tyrosine hydroxylase (TH)-positive cell bodies (A12 cells), both in the dorsomedial and ventrolateral subdivisions, with a higher number in the latter. GAL-LI coexisted in glutamic acid decarboxylase (GAD)-positive somata in the posterior aspects of the arcuate nucleus and at all rostrocaudal levels in fibers in the external layer of the median eminence. In the anterior hypothalamus, a large population of the cells of the parvocellular and magnocellular paraventricular nuclei contained both GAL-LI and vasopressin-LI. Moreover, somata containing both GAD- and GAL-LI were seen lateral to the mammillary recess in the tuberal and caudal magnocellular nuclei. Some of the neurons of the caudal group were shown to project to the occipital cortex using combined retrograde tracing and immunofluorescence. With regard to mesencephalic and medullary catecholamine neurons, GAL-LI coexisted in a large proportion of the noradrenergic locus coeruleus somata (A6 cell group) and in the A4 group dorsolateral to the fourth ventricle, as well as in the caudal parts of the A2 group in the dorsal vagal complex. However, in more rostral parts of the latter, especially in the medial subdivision of the solitary tract nucleus, a very large population of GAL-IR small cell bodies was seen intermingling with catecholamine neurons, but they did not contain TH-LI. Furthermore, GAL-IR cell bodies coextensive with, but not coexisting in, TH-IR somata were seen in the C1 (epinephrine) horea in the ventrolateral medulla at the level of area postrema and in the most rostral aspects of the C1 group. Finally, 5-HT-positive cell bodies of the mesencephalic and medullary raphe nuclei and a subpopulation of coarse 5-HT nerve fibers in the hippocampus co-contained GAL-LI. The present results demonstrate that a GAL-like peptide is present in many systems containing other neuroactive compounds, including dopamine, norepinephrine, 5-HT, GABA, and vasopressin.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)

Phaeochromocytomas and paragangliomas are neuro-endocrine tumours that occur sporadically and in several hereditary tumour syndromes, including the phaeochromocytoma-paraganglioma syndrome. This syndrome is caused by germline mutations in succinate dehydrogenase B (SDHB), C (SDHC), or D (SDHD) genes. Clinically, the phaeochromocytoma-paraganglioma syndrome is often unrecognised, although 10-30% of apparently sporadic phaeochromocytomas and paragangliomas harbour germline SDH-gene mutations. Despite these figures, the screening of phaeochromocytomas and paragangliomas for mutations in the SDH genes to detect phaeochromocytoma-paraganglioma syndrome is rarely done because of time and financial constraints. We investigated whether SDHB immunohistochemistry could effectively discriminate between SDH-related and non-SDH-related phaeochromocytomas and paragangliomas in large retrospective and prospective tumour series.Immunohistochemistry for SDHB was done on 220 tumours. Two retrospective series of 175 phaeochromocytomas and paragangliomas with known germline mutation status for phaeochromocytoma-susceptibility or paraganglioma-susceptibility genes were investigated. Additionally, a prospective series of 45 phaeochromocytomas and paragangliomas was investigated for SDHB immunostaining followed by SDHB, SDHC, and SDHD mutation testing.SDHB protein expression was absent in all 102 phaeochromocytomas and paragangliomas with an SDHB, SDHC, or SDHD mutation, but was present in all 65 paraganglionic tumours related to multiple endocrine neoplasia type 2, von Hippel-Lindau disease, and neurofibromatosis type 1. 47 (89%) of the 53 phaeochromocytomas and paragangliomas with no syndromic germline mutation showed SDHB expression. The sensitivity and specificity of the SDHB immunohistochemistry to detect the presence of an SDH mutation in the prospective series were 100% (95% CI 87-100) and 84% (60-97), respectively.Phaeochromocytoma-paraganglioma syndrome can be diagnosed reliably by an immunohistochemical procedure. SDHB, SDHC, and SDHD germline mutation testing is indicated only in patients with SDHB-negative tumours. SDHB immunohistochemistry on phaeochromocytomas and paragangliomas could improve the diagnosis of phaeochromocytoma-paraganglioma syndrome.The Netherlands Organisation for Scientific Research, Dutch Cancer Society, Vanderes Foundation, Association pour la Recherche contre le Cancer, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, and a PHRC grant COMETE 3 for the COMETE network.

Abstract Various pathologic conditions, such as hemorrhage, hemolysis and cell injury, are characterized by the release of large amounts of heme. Recently, it was demonstrated that heme oxygenase (HO), the heme-degrading enzyme, and heme are able to modulate adhesion molecule expression in vitro. In the present study, the effects of heme and HO on inflammation in mice were analyzed by monitoring the biodistribution of radiolabeled liposomes and leukocytes in conjunction with immunohistochemistry. Small liposomes accumulate in inflamed tissues by diffusion because of locally enhanced vascular permeability, whereas leukocytes actively migrate into inflammatory areas through specific adhesive interactions with the endothelium and chemotaxis. Exposure to heme resulted in a dramatic increase in liposome accumulation in the pancreas, but also intestines, liver, and spleen exhibited significantly increased vascular permeability. Similarly, intravenously administered heme caused an enhanced influx of radiolabeled leukocytes into these organs. Immunohistochemical analysis showed differential up-regulation of the adhesion molecules ICAM-1, P-selectin, and fibronectin in liver and pancreas in heme-treated animals. Heme-induced adhesive properties were accompanied by a massive influx of granulocytes into these inflamed tissues, suggesting an important contribution to the pathogenesis of inflammatory processes. Moreover, inhibition of HO activity exacerbated heme-induced granulocyte infiltration. Here it is demonstrated for the first time that heme induces increased vascular permeability, adhesion molecule expression, and leukocyte recruitment in vivo, whereas HO antagonizes heme-induced inflammation possibly through the down-modulation of adhesion molecules.

The distribution of serotonin-immunoreactive varicosities in the paraventricular (PVH) and supraoptic (SO) nuclei was charted in normal immunohistochemical material and the probable cells of origin of these projections were identified using a combined retrograde transport-immunohistochemical method. The density of serotonergic fibers in the PVH and the SO is quite low relative to that in the immediately surrounding neuropil, in striking contrast to noradrenergic inputs to the nuclei. Immunoreactive fibers are concentrated in specific parts of the parvocellular division of the PVH, whereas in the magnocellular division of the nucleus, and in the SO, they are found mostly in regions where oxytocinergic cells predominate. These projections appear to arise from 3 distinct serotonergic cell groups (B7, B8 and B9) in the midbrain.