Abstract Substantial efforts are being made to optimize the CRISPR/Cas9 system for precision crop breeding. The avoidance of transgene integration and reduction of off-target mutations are the most important targets for optimization. Here, we describe an efficient genome editing method for bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins (RNPs). Starting from RNP preparation, the whole protocol takes only seven to nine weeks, with four to five independent mutants produced from 100 immature wheat embryos. Deep sequencing reveals that the chance of off-target mutations in wheat cells is much lower in RNP mediated genome editing than in editing with CRISPR/Cas9 DNA. Consistent with this finding, no off-target mutations are detected in the mutant plants. Because no foreign DNA is used in CRISPR/Cas9 RNP mediated genome editing, the mutants obtained are completely transgene free. This method may be widely applicable for producing genome edited crop plants and has a good prospect of being commercialized.

Abstract Editing plant genomes is technically challenging in hard-to-transform plants and usually involves transgenic intermediates, which causes regulatory concerns. Here we report two simple and efficient genome-editing methods in which plants are regenerated from callus cells transiently expressing CRISPR/Cas9 introduced as DNA or RNA. This transient expression-based genome-editing system is highly efficient and specific for producing transgene-free and homozygous wheat mutants in the T0 generation. We demonstrate our protocol to edit genes in hexaploid bread wheat and tetraploid durum wheat, and show that we are able to generate mutants with no detectable transgenes. Our methods may be applicable to other plant species, thus offering the potential to accelerate basic and applied plant genome-engineering research.

Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems have emerged as powerful tools for genome editing in a variety of species. Here, we report, for the first time, targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system. We designed five TALENs targeting 4 genes, namely ZmPDS, ZmIPK1A, ZmIPK, ZmMRP4, and obtained targeting efficiencies of up to 23.1% in protoplasts, and about 13.3% to 39.1% of the transgenic plants were somatic mutations. Also, we constructed two gRNAs targeting the ZmIPK gene in maize protoplasts, at frequencies of 16.4% and 19.1%, respectively. In addition, the CRISPR/Cas system induced targeted mutations in Z. mays protoplasts with efficiencies (13.1%) similar to those obtained with TALENs (9.1%). Our results show that both TALENs and the CRISPR/Cas system can be used for genome modification in maize.

Summary Fragrant rice is favoured worldwide because of its agreeable scent. The presence of a defective badh2 allele encoding betaine aldehyde dehydrogenase ( BADH 2) results in the synthesis of 2‐acetyl‐1‐pyrroline (2 AP ), which is a major fragrance compound. Here, transcription activator‐like effector nucleases ( TALEN s) were engineered to target and disrupt the Os BADH 2 gene. Six heterozygous mutants (30%) were recovered from 20 transgenic hygromycin‐resistant lines. Sanger sequencing confirmed that these lines had various indel mutations at the TALEN target site. All six transmitted the BADH 2 mutations to the T1 generation; and four T1 mutant lines tested also efficiently transmitted the mutations to the T2 generation. Mutant plants carrying only the desired DNA sequence change but not the TALEN transgene were obtained by segregation in the T1 and T2 generations. The 2 AP content of rice grains of the T1 lines with homozygous mutations increased from 0 to 0.35–0.75 mg/kg, which was similar to the content of a positive control variety harbouring the badh2‐E7 mutation. We also simultaneously introduced three different pairs of TALEN s targeting three separate rice genes into rice cells by bombardment and obtained lines with mutations in one, two and all three genes. These results indicate that targeted mutagenesis using TALEN s is a useful approach to creating important agronomic traits.

Summary GW 2 is emerging as a key genetic determinant of grain weight in cereal crops; it has three homoeologs ( Ta GW 2‐A1 , ‐B1 and ‐D1 ) in hexaploid common wheat ( Triticum aestivum L.). Here, by analyzing the gene editing mutants that lack one ( B1 or D1 ), two ( B1 and D1 ) or all three ( A1 , B1 and D1 ) homoeologs of Ta GW 2 , several insights are gained into the functions of Ta GW 2‐B1 and ‐D1 in common wheat grain traits. First, both Ta GW 2‐B1 and ‐D1 affect thousand‐grain weight ( TGW ) by influencing grain width and length, but the effect conferred by Ta GW 2‐B1 is stronger than that of Ta GW 2‐D1 . Second, there exists functional interaction between Ta GW 2 homoeologs because the TGW increase shown by a double mutant (lacking B1 and D1 ) was substantially larger than that of their single mutants. Third, both Ta GW 2‐B1 and ‐D1 modulate cell number and length in the outer pericarp of developing grains, with Ta GW 2‐B1 being more potent. Finally, Ta GW 2 homoeologs also affect grain protein content as this parameter was generally increased in the mutants, especially in the lines lacking two or three homoeologs. Consistent with this finding, two wheat end‐use quality‐related parameters, flour protein content and gluten strength, were considerably elevated in the mutants. Collectively, our data shed light on functional difference between and additive interaction of Ta GW 2 homoeologs in the genetic control of grain weight and protein content traits in common wheat, which may accelerate further research on this important gene and its application in wheat improvement.