A large French family including members affected by nonspecific X-linked mental retardation, with or without autism or pervasive developmental disorder in affected male patients, has been found to have a 2–base-pair deletion in the Neuroligin 4 gene (NLGN4) located at Xp22.33. This mutation leads to a premature stop codon in the middle of the sequence of the normal protein and is thought to suppress the transmembrane domain and sequences important for the dimerization of neuroligins that are required for proper cell-cell interaction through binding to β-neurexins. As the neuroligins are mostly enriched at excitatory synapses, these results suggest that a defect in synaptogenesis may lead to deficits in cognitive development and communication processes. The fact that the deletion was present in both autistic and nonautistic mentally retarded males suggests that the NLGN4 gene is not only involved in autism, as previously described, but also in mental retardation, indicating that some types of autistic disorder and mental retardation may have common genetic origins. A large French family including members affected by nonspecific X-linked mental retardation, with or without autism or pervasive developmental disorder in affected male patients, has been found to have a 2–base-pair deletion in the Neuroligin 4 gene (NLGN4) located at Xp22.33. This mutation leads to a premature stop codon in the middle of the sequence of the normal protein and is thought to suppress the transmembrane domain and sequences important for the dimerization of neuroligins that are required for proper cell-cell interaction through binding to β-neurexins. As the neuroligins are mostly enriched at excitatory synapses, these results suggest that a defect in synaptogenesis may lead to deficits in cognitive development and communication processes. The fact that the deletion was present in both autistic and nonautistic mentally retarded males suggests that the NLGN4 gene is not only involved in autism, as previously described, but also in mental retardation, indicating that some types of autistic disorder and mental retardation may have common genetic origins. X-linked mental retardation (XLMR) is a highly heterogeneous condition, including >140 distinct disorders and affecting ∼1.6/1,000 males, with a carrier frequency of 2.4/1,000 females (Herbst and Miller Herbst and Miller, 1980Herbst DS Miller JR Nonspecific X-linked mental retardation II: the frequency in British Columbia.Am J Med Genet. 1980; 7: 461-469Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar; Stevenson and Schwartz Stevenson and Schwartz, 2002Stevenson RE Schwartz CE Clinical and molecular contributions to the understanding of X-linked mental retardation.Cytogenet Genome Res. 2002; 99: 265-275Crossref PubMed Scopus (42) Google Scholar). Two groups have been defined: nonspecific forms (MRX), in which mental retardation (MR) is the only clinical manifestation, and syndromic forms (MRXS), in which MR is associated with recognizable physical signs such as skeletal abnormalities or dysmorphic facial features (Chelly and Mandel Chelly and Mandel, 2001Chelly J Mandel JL Monogenic causes of X-linked mental retardation.Nat Rev Genet. 2001; 2: 669-680Crossref PubMed Scopus (223) Google Scholar). Both MRX and MRXS genes have been located at various regions of the X chromosome (Chiurazzi et al. Chiurazzi et al., 2001Chiurazzi P Hamel BC Neri G XLMR genes: update 2000.Eur J Hum Genet. 2001; 9: 71-81Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar). To date, it is estimated that at least 30 genes are involved in MRX, but only 14 have been isolated. Autism is a neurodevelopmental disorder beginning before the age of 3 years and characterized by severe social and communication impairments, repetitive and ritualistic behaviors, and a restricted pattern of interests (American Psychiatric Association American Psychiatric Association, 1994American Psychiatric Association Diagnostic and statistical manual of mental disorders. 4th ed (DSM-IV). American Psychiatric Association, Washington, DC1994Google Scholar). The prevalence of autism is estimated at ∼10/10,000 when broader definitions are used (Fombonne Fombonne, 2003Fombonne E Epidemiological surveys of autism and other pervasive developmental disorders: an update.J Autism Dev Disord. 2003; 33: 365-382Crossref PubMed Scopus (1003) Google Scholar). Many studies, including correlation in twins and association of autism with Mendelian diseases, have supported a genetic etiology for this condition. Nevertheless, autism appears to be clinically and genetically heterogeneous, suggesting that multiple loci are involved (Risch et al. Risch et al., 1999Risch N Spiker D Lotspeisch L Nouri N Hinds D Hallmayer J Kalaydjieva L et al.A genomic screen of autism: evidence for a multilocus etiology.Am J Hum Genet. 1999; 65: 493-507Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (543) Google Scholar). The male/female sex ratio for autism is estimated at 4:1 (Fombonne Fombonne, 2003Fombonne E Epidemiological surveys of autism and other pervasive developmental disorders: an update.J Autism Dev Disord. 2003; 33: 365-382Crossref PubMed Scopus (1003) Google Scholar), and several genome screens have shown that at least two loci on the X chromosome are associated with a predisposition to autism—that is, Xp22.3 and Xq13-21 (Philippe et al. Philippe et al., 1999Philippe A Martinez M Guilloud-Bataille M Gillberg C Rastam M Sponheim E Coleman M Zappella M Aschauer H van Maldergem L Penet C Feingold J Brice A Leboyer M van Malldergerme L Genome-wide scan for autism susceptibility genes. Paris Autism International Sibpair Study.Hum Mol Genet. 1999; 8: 805-812Crossref PubMed Scopus (418) Google Scholar; Auranen et al. Auranen et al., 2002Auranen M Vanhala R Varilo T Ayers K Kempas E Ylisaukko-Oja T Sinsheimer JS Peltonen L Jarvela I A genomewide screen for autism-spectrum disorders: evidence for a major susceptibility locus on chromosome 3q25–27.Am J Hum Genet. 2002; 71: 777-790Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (178) Google Scholar). The report of a de novo chromosomal deletion at Xp22.3 in three unrelated autistic females (Thomas et al. Thomas et al., 1999Thomas NS Sharp AJ Browne CE Skuse D Hardie C Dennis NR Xp deletions associated with autism in three females.Hum Genet. 1999; 104: 43-48Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar) and a nonsense mutation recently found in the Neuroligin 4 (NLGN4) gene in a family with two non–mentally retarded brothers with autism and Asperger syndrome (MIM 300427) respectively (Jamain et al. Jamain et al., 2003Jamain S Quach H Betancur C Rastam M Colineaux C Gillberg IC Soderstrom H Giros B Leboyer M Cillberg C Bourgeron T Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Paris Autism Research International Sibpair Study.Nat Genet. 2003; 34: 27-29Crossref PubMed Scopus (1276) Google Scholar), suggest that this gene could be involved in autistic disorders. Wide intra- and extrafamilial phenotype heterogeneity exists in MRX conditions. Mild-to-severe MR and association with psychiatric disorders such as autism is frequently reported. MR is present in ∼70% of individuals with autism, and in half of these individuals intellectual quotient (IQ) is evaluated as <50 (Fombonne Fombonne, 2002Fombonne E Epidemiological trends in rates of autism.Mol Psychiatry. 2002; : 4-6Crossref Scopus (148) Google Scholar). Among 25 French families including 135 male patients with MRX135, we found 7 families with at least one mentally retarded male with autistic disorder, according to criteria of the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition (DSM-IV [American Psychiatric Association American Psychiatric Association, 1994American Psychiatric Association Diagnostic and statistical manual of mental disorders. 4th ed (DSM-IV). American Psychiatric Association, Washington, DC1994Google Scholar]). Fragile X syndrome (FRAXA) was excluded, and diagnosis of isolated MR or MR associated with autistic symptoms was made after examination of the patients (Gomot et al., unpublished data). We present here the molecular and clinical data of one of these families (family T118) in which we found a null mutation in the NLGN4 gene in autistic and nonautistic mentally retarded males. The pedigree of the family is shown in figure 1. In this family, 13 males have been identified as having autism, MR, or pervasive developmental disorder; for eight subjects, this diagnosis was based on direct medical examination or on their medical records (table 1). Interviews of the nonaffected family members confirmed that the other subjects were institutionalized and that one of them was killed in a road accident (individual III-8).Table 1Summary of Clinical FindingsFinding in SubjectMaleAffectedCharacteristicsIII-2aInstitutionalized patient.III-3III-4aInstitutionalized patient.III-7aInstitutionalized patient.IV-3aInstitutionalized patient.III-11IV-7aInstitutionalized patient.IV-10III-15IV-14aInstitutionalized patient.III-27aInstitutionalized patient.IV-23Unaffected, IV-9Female, III-14Age at examination (years)NA44NANANA4211830NANA161334Dysmorphic featuresNoPlagiocephalyNDNDNDNoNDPlagiocephalyNoNDNDNoNoNoIntelligenceNDMild MRNDNDNDSubnormalNDMild MRSubnormalNDNDSubnormalNormalNormalAutismNDNoNDNDNDNoYesYesNoNoNoNoIQ: TotalND63NDNDND77ND6272NDND7414296 VerbalND70NDNDND82ND3779NDND7612790 PerformanceND60NDNDND75ND8863NDND75141105Note.—NA = not available; ND = not determined.a Institutionalized patient. Open table in a new tab Note.— NA = not available; ND = not determined. Patient IV-10 was aged 8 years 1 mo at the time of the clinical evaluation by a child psychiatrist and by a psychologist. He met diagnostic criteria for autistic disorder (DSM-IV [American Psychiatric Association American Psychiatric Association, 1994American Psychiatric Association Diagnostic and statistical manual of mental disorders. 4th ed (DSM-IV). American Psychiatric Association, Washington, DC1994Google Scholar]). Diagnostic evaluation also included the Autism Diagnostic Interview—Revised (ADI [Lord et al. Lord et al., 1994Lord C Rutter M Lecouteur A Autism diagnostic interview—revised: a revised version of a diagnostic interview for caregivers of individuals with possible pervasive developmental disorders.J Autism Dev Disord. 1994; 24: 659-685Crossref PubMed Scopus (6292) Google Scholar]). His ADI scores were 13 in the social domain (cutoff = 8), 13 in the language (verbal) domain (cutoff = 8), and 4 in the repetitive/restrictive behaviors domain (cutoff = 3). Developmental abnormalities were identified before 36 mo of age. Developmental ages for the Vineland Adaptative Behavior Scale (Sparrow et al. Sparrow et al., 1985Sparrow SS Balla DA Cicchetti DV Vineland adaptative behavior scales: classroom edition. American Guidance Service, Circle Pines, MN1985Google Scholar) were 3 years 2 mo, for communication, 3 years 10 mo, for daily living skills, 2 years 9 mo, for socialization, and 4 years 11 mo, for motor skills. The intellectual assessment was made using the age-appropriate Wechsler Preschool and Primary Scale of Intelligence—Revised (WPPSI-R [Wechsler Wechsler, 1989Wechsler D Manual for the Wechsler preschool and primary scale of intelligence—revised. Psychological Corporation, New York1989Google Scholar]), providing verbal and performance IQs of 37 and 88, respectively, and an overall IQ of 62, which led to an associated diagnosis of mild MR. Physical examination revealed normal growth parameters with no discernible dysmorphic features, except for posterior plagiocephaly. Electroencephalogram (EEG) and morphometric MRI results showed no abnormalities. Late auditory evoked potentials with mismatch-negativity paradigm showed a typical profile for children with autism (Gomot et al. Gomot et al., 2002Gomot M Giard MH Adrien JL Barthelemy C Bruneau N Hypersensivity to acoustic change in children with autism: electrophysiological evidence of left frontal cortex dysfunctioning.Psychophysiology. 2002; 39: 577-584Crossref PubMed Google Scholar). His mother (III-14), a 34-year-old obligate carrier, was tested with the Wechsler Adult Intelligence Scale—III (WAIS-III [Wechsler Wechsler, 1997Wechsler D Wechsler adult intelligence scale. 3rd ed. Psychological Corporation, New York1997Google Scholar]) and had a verbal IQ of 90, a performance IQ of 105, and an overall IQ of 96. Her subscore in nonverbal analogic treatment indicated retardation, with a developmental age of 10 years. Patients III-3 and III-11 were 44 and 42 years of age, respectively, when they were examined (using the WAIS-III) by a psychiatrist with experience of working with children and adults with developmental disorders. They met DSM-IV criteria for MR without an associated psychiatric disorder. Patient III-3 had mild MR with a verbal IQ of 70, a performance IQ of 60, and an overall IQ of 63. Patient III-11 had subnormal intelligence with a verbal IQ of 82, a performance IQ of 75, and an overall IQ of 77. Patient III-11 had no dysmorphic features. He had a head trauma injury at the age of 4 years that resulted in coma for 6 d. Patient III-3 presented posterior plagiocephaly. His work environment was adapted for mentally handicapped adults. Patient III-4 declined psychiatric examination but was admitted to a psychiatric unit for aggressive behavior at the time of his brother's clinical interview. Clinical information on patient III-15, a 30-year-old man, was taken from an interview with his mother and from his medical records. He was born after three miscarriages. Delivery was normal. He experienced hypoxic-ischemic events in the first weeks of life, with epileptic seizures from 1 to 9 years of age. Psychomotor development was retarded, and he could sit alone at the age of 2 years. He was tested with the WAIS-III and had subnormal intelligence with a verbal IQ of 79, a performance IQ of 63, and an overall IQ of 72. He receives an allowance for mentally handicapped adults. He is friendly and sociable. Clinical information on patient IV-23 was taken from medical records. At the age of 2.5 years, he was admitted to a children's psychiatric unit. He was identified as having pervasive developmental disorder, not otherwise specified (PDD-NOS). He was 16 years of age when he was assessed with the Weschler Adult Intelligence Scale—Revised (WAIS-R [Wechsler Wechsler, 1981Wechsler D Wechsler adult intelligence scale—revised. Psychological Corp., NewYork1981Google Scholar]), and he had a verbal IQ of 76, a performance IQ of 75, and an overall IQ of 74. He also presented transient tic disorder and received neuroleptic treatment. The only available medical information concerning patient IV-7, an 11-year-old boy, is that his condition was diagnosed as autism in a children's psychiatric unit. In family T118, two-point linkage analysis by use of 41 DNA markers spanning the X chromosome indicated a strong linkage of XLMR to Xp21.2-pter, with a maximum LOD score of 3.30 (θ=0) for DXS996 and DXS989. Several previously isolated MRX genes fall within the linkage interval, such as RSK2 (Merienne et al. Merienne et al., 1999Merienne K Jacquot S Pannetier S Zeniou M Bankier A Gecz J Mandel JL Mulley J Sassone-Corsi P Hanauer A A missense mutation in RPS6KA3 (RSK2) responsible for non-specific mental retardation.Nat Genet. 1999; 22: 13-14Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar), IL1RAPL (Carrie et al. Carrie et al., 1999Carrie A Jun L Bienvenu T Vinet MC McDonell N Couvert P Zemni R Cardona A Van Buggenhout G Frints S Hamel B Moraine C Ropers HH Strom T Howell GR Whittaker A Ross MT Kahn A Fryns JP Beldjord C Marynen P Chelly J A new member of the IL-1 receptor family highly expressed in hippocampus and involved in X-linked mental retardation.Nat Genet. 1999; 23: 25-31Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar), VCX (Fukami et al. Fukami et al., 2000Fukami M Kirsch S Schiller S Richter A Benes V Franco B Muroya K Rao E Merker S Niesler S Ballabio A Ansorge W Ogata T Rappold GA A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked non-specific mental retardation.Am J Hum Genet. 2000; 67: 563-573Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (91) Google Scholar), and ARX (Bienvenu et al. Bienvenu et al., 2002Bienvenu T Poirier K Friocourt G Bahi N Beaumont D Fauchereau F Ben Jeema L Zemni R Vinet MC Francis F Couvert P Gomot M Moraine C van Bokhoven H Kalscheuer V Frints S Gecz J Ohzaki K Chaabouni H Fryns JP Desportes V Beldjord C Chelly J ARX, a novel Prd-class-homeobox gene highly expressed in the telencephalon, is mutated in X-linked mental retardation.Hum Mol Genet. 2002; 11: 981-991Crossref PubMed Scopus (237) Google Scholar; Stromme et al. Stromme et al., 2002Stromme P Mangelsdorf ME Shaw MA Lower KM Lewis SM Bruyere H Lutcherath V Gedeon AK Wallace RH Scheffer IE Turner G Partington M Frints SG Fryns JP Sutherland GR Mulley JC Gecz J Mutations in the human ortholog of Aristaless cause X-linked mental retardation and epilepsy.Nat Genet. 2002; 30: 441-445Crossref PubMed Scopus (368) Google Scholar). Furthermore, the report of de novo Xp deletions in three females with autism (Thomas et al. Thomas et al., 1999Thomas NS Sharp AJ Browne CE Skuse D Hardie C Dennis NR Xp deletions associated with autism in three females.Hum Genet. 1999; 104: 43-48Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar) and the description of a susceptibility locus at DXS996 (Philippe et al. Philippe et al., 1999Philippe A Martinez M Guilloud-Bataille M Gillberg C Rastam M Sponheim E Coleman M Zappella M Aschauer H van Maldergem L Penet C Feingold J Brice A Leboyer M van Malldergerme L Genome-wide scan for autism susceptibility genes. Paris Autism International Sibpair Study.Hum Mol Genet. 1999; 8: 805-812Crossref PubMed Scopus (418) Google Scholar) suggested that a gene involved in autistic disorder was located at Xpter. A gene encoding for a member of the neuroligin family, named "Neuroligin 4" (NLGN4 or KIAA1260), has recently been mapped to Xp22.33 (obtained from the Ensembl Genome Browser) and closely linked to DXS996 (Bolliger et al. Bolliger et al., 2001Bolliger MF Frei K Winterhalter KH Gloor SM Identification of a novel neuroligin in humans which binds to PSD-95 and has a widespread expression.Biochem J. 2001; 356: 581-588Crossref PubMed Scopus (107) Google Scholar), and a mutation was found in two brothers with autism and Asperger syndrome, both without MR (Jamain et al. Jamain et al., 2003Jamain S Quach H Betancur C Rastam M Colineaux C Gillberg IC Soderstrom H Giros B Leboyer M Cillberg C Bourgeron T Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Paris Autism Research International Sibpair Study.Nat Genet. 2003; 34: 27-29Crossref PubMed Scopus (1276) Google Scholar). We sequenced this gene in the members of family T118 for whom genomic DNA was available (fig. 1). After PCR analysis of the coding exons, the products were directly sequenced. We detected a 2-bp deletion, nt1253del(AG) (GenBank accession numbers: NM_020742, AF376803), in the fifth exon of NLGN4 in all affected patients (fig. 2a). This deletion caused a frameshift in the coding sequence and was predicted to create a stop codon at position 429 (fig. 2b). The healthy males did not carry the deletion, and the obligate carrier females were heterozygous for the mutation. We did not observe this deletion in 200 healthy male controls, and analysis of the X-chromosome inactivation profile in the obligate carrier females was not informative. The resulting mutated protein is predicted to be truncated by ∼50% of its normal sequence (429 amino acids, instead of 816) and to lose the C-terminal transmembrane domain. We also screened for mutations of this gene in eight families collected by the European XLMR consortium with MRX overlapping Xp22.33 regions and DXS996 (including family MRX49 [Claes et al. Claes et al., 1997Claes S Vogels A Holvoet M Devriendt K Rayemaekers P Cassiman JJ Fryns JP Regional localization of two genes for non-specific X-linked mental retardation to Xp22.3-p22.2 (MRX49) and Xp11.3-p11.21 (MRX50).Am J Med Genet. 1997; 73: 474-479Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar] and seven small families with two affected brothers), but we failed to detect any variations in the coding sequence. The other families with MRX and autism were not screened for the NLGN4 gene because their linkage area did not fall in Xp22.33. Jamain et al. (Jamain et al., 2003Jamain S Quach H Betancur C Rastam M Colineaux C Gillberg IC Soderstrom H Giros B Leboyer M Cillberg C Bourgeron T Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Paris Autism Research International Sibpair Study.Nat Genet. 2003; 34: 27-29Crossref PubMed Scopus (1276) Google Scholar) recently reported a nonsense mutation in NLGN4 that led to a predicted truncated protein of 396 amino acids in a Swedish family with two affected brothers who exhibited autism or Asperger syndrome, both without MR. Our study showed the involvement of the same gene in XLMR with or without autism. Altogether, these results suggest that mutations in NLGN4 are involved in a wide spectrum of phenotypes, ranging from mild isolated MR without communication deficits (family T118) to Asperger syndrome with normal or supranormal intelligence (Jamain et al. Jamain et al., 2003Jamain S Quach H Betancur C Rastam M Colineaux C Gillberg IC Soderstrom H Giros B Leboyer M Cillberg C Bourgeron T Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Paris Autism Research International Sibpair Study.Nat Genet. 2003; 34: 27-29Crossref PubMed Scopus (1276) Google Scholar). The phenotypic heterogeneity of this X-linked condition suggests that the expression of the mutation is modulated by genetic or nongenetic factors. The NLGN4 gene belongs to the neuroligin family made up of neuronal cell-surface proteins located in the synaptic structures. They are composed of a large extracellular noncatalytic acetylcholinesterase homology domain, which is required for presynaptic neurexin binding, a transmembrane domain, and a short cytoplasmic tail with a postsynaptic density 95-disc large zona-occludens-1 (PDZ) binding domain (fig. 2). They are particularly abundant in the postsynaptic membrane of glutamatergic synapses, suggesting specific targeting to excitatory synapses (Song et al. Song et al., 1999Song JY Ichtchenko K Südhof TC Brose N Neuroligin 1 is a postsynaptic cell-adhesion molecule of excitatory synapses.Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96: 1100-1105Crossref PubMed Scopus (513) Google Scholar). Experiments in vitro have shown that the intercellular neuroligin-neurexin adhesion complex is able to trigger formation of functional presynaptic elements and leads to axon specialization (Scheiffele et al. Scheiffele et al., 2000Scheiffele P Fan J Choih J Fetter R Serafini T Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.Cell. 2000; 101: 657-669Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (910) Google Scholar). As the neuroligin C-terminus binds the postsynaptic proteins PSD-95 and S-SCAM that link neuroligins to NMDA receptors and downstream signal-transducing proteins, the neuroligin-neurexin interaction may also mediate postsynaptic differentiation (Rao et al. Rao et al., 2000Rao A Harms KJ Craig AM Neuroligation: building synapses around the neurexin-neuroligin link.Nat Neurosci. 2000; 3: 747-749Crossref PubMed Scopus (42) Google Scholar). A previous study has shown that oligomerization of neuroligins is required for their activity in synaptogenesis. Dean et al. (Dean et al., 2003Dean C Scholl FG Choih J DeMaria S Berger J Isacoff E Scheiffele P Neurexin mediates the assembly of presynaptic terminals.Nat Neurosci. 2003; 6: 708-716Crossref PubMed Scopus (440) Google Scholar) demonstrated that two alpha helices located at the base of the AchE-homologous domain of NLGN1 were critical for interaction between other neuroligins, with inactivating amino acid mutations that affect multimerization and reduce the synapse-promoting activity of the protein. Although these experiments were performed with constructs from the Neuroligin 1 gene that shares 71.2% identity with NLGN4 in their amino acid sequences, we can expect that the mutated NLGN4 protein will lack structural elements indispensable for its specific activity. Indeed, the sequence homology between NLGN1 and NLGN4 and the position of the mutation in NLGN4 in family T118 indicates that these regions, which are important for oligomerization, were deleted, thus potentially leading to a loss of synaptogenic activity (fig. 2c). In summary, we report a new gene involved in XLMR, which is also associated with autism and pervasive developmental disorder. Moreover, this gene has also been reported to be involved in autism and Asperger syndrome without MR, suggesting strong phenotypic heterogeneity. We propose that NLGN4 deficiency in the brain may lead to abnormal development of synaptic structures and may have dramatic effects on communication processes and cognitive development. The generation of animal models with null mutations of this gene would provide an approach to the functional consequences of such a deficiency. We thank the patients, members of family T118, and the European XLMR consortium for their participation in this study. We also thank Catherine Cherpi-Antar and Brigitte Jauffrion for technical assistance. This work was supported by grants from Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale (INSERM), Fondation Jerome Lejeune, Fondation de France, Fondation France Telecom, and by the 5th EU Framework (RTD Project-QLRT-2001-01810) and the GIS maladies rares (project A021817GS). Accession numbers and URLs for data presented herein are as follows: Ensembl Genome Browser, http://www.ensembl.org GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/ (for NLGN4 mRNA [accession numbers NM_020742 and AF376803]) Kazusa DNA Research Institute, http://www.kazusa.or.jp/huge (for information about KIAA clones) Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/

Loss-of-function mutations of the MECP2 gene at Xq28 are associated with Rett syndrome in females and with syndromic and nonsyndromic forms of mental retardation (MR) in males. By array comparative genomic hybridization (array-CGH), we identified a small duplication at Xq28 in a large family with a severe form of MR associated with progressive spasticity. Screening by real-time quantitation of 17 additional patients with MR who have similar phenotypes revealed three more duplications. The duplications in the four patients vary in size from 0.4 to 0.8 Mb and harbor several genes, which, for each duplication, include the MR-related L1CAM and MECP2 genes. The proximal breakpoints are located within a 250-kb region centromeric of L1CAM, whereas the distal breakpoints are located in a 300-kb interval telomeric of MECP2. The precise size and location of each duplication is different in the four patients. The duplications segregate with the disease in the families, and asymptomatic carrier females show complete skewing of X inactivation. Comparison of the clinical features in these patients and in a previously reported patient enables refinement of the genotype-phenotype correlation and strongly suggests that increased dosage of MECP2 results in the MR phenotype. Our findings demonstrate that, in humans, not only impaired or abolished gene function but also increased MeCP2 dosage causes a distinct phenotype. Moreover, duplication of the MECP2 region occurs frequently in male patients with a severe form of MR, which justifies quantitative screening of MECP2 in this group of patients. Loss-of-function mutations of the MECP2 gene at Xq28 are associated with Rett syndrome in females and with syndromic and nonsyndromic forms of mental retardation (MR) in males. By array comparative genomic hybridization (array-CGH), we identified a small duplication at Xq28 in a large family with a severe form of MR associated with progressive spasticity. Screening by real-time quantitation of 17 additional patients with MR who have similar phenotypes revealed three more duplications. The duplications in the four patients vary in size from 0.4 to 0.8 Mb and harbor several genes, which, for each duplication, include the MR-related L1CAM and MECP2 genes. The proximal breakpoints are located within a 250-kb region centromeric of L1CAM, whereas the distal breakpoints are located in a 300-kb interval telomeric of MECP2. The precise size and location of each duplication is different in the four patients. The duplications segregate with the disease in the families, and asymptomatic carrier females show complete skewing of X inactivation. Comparison of the clinical features in these patients and in a previously reported patient enables refinement of the genotype-phenotype correlation and strongly suggests that increased dosage of MECP2 results in the MR phenotype. Our findings demonstrate that, in humans, not only impaired or abolished gene function but also increased MeCP2 dosage causes a distinct phenotype. Moreover, duplication of the MECP2 region occurs frequently in male patients with a severe form of MR, which justifies quantitative screening of MECP2 in this group of patients.

Tarpey et al. carry out a large-scale systematic sequencing of the majority of X-chromosome coding exons from 208 families with multiple individuals with mental retardation and a pattern of transmission compatible with X linkage in order to identify XLMR-causative mutations. They find several mutations that appear to be causative in loci already known to be involved in XLMR, as well as new data about those loci, and make inferences about the role of the different classes of variants in these diseases. Large-scale systematic resequencing has been proposed as the key future strategy for the discovery of rare, disease-causing sequence variants across the spectrum of human complex disease. We have sequenced the coding exons of the X chromosome in 208 families with X-linked mental retardation (XLMR), the largest direct screen for constitutional disease-causing mutations thus far reported. The screen has discovered nine genes implicated in XLMR, including SYP, ZNF711 and CASK reported here, confirming the power of this strategy. The study has, however, also highlighted issues confronting whole-genome sequencing screens, including the observation that loss of function of 1% or more of X-chromosome genes is compatible with apparently normal existence.

X-linked intellectual disability (XLID) is a clinically and genetically heterogeneous disorder. During the past two decades in excess of 100 X-chromosome ID genes have been identified. Yet, a large number of families mapping to the X-chromosome remained unresolved suggesting that more XLID genes or loci are yet to be identified. Here, we have investigated 405 unresolved families with XLID. We employed massively parallel sequencing of all X-chromosome exons in the index males. The majority of these males were previously tested negative for copy number variations and for mutations in a subset of known XLID genes by Sanger sequencing. In total, 745 X-chromosomal genes were screened. After stringent filtering, a total of 1297 non-recurrent exonic variants remained for prioritization. Co-segregation analysis of potential clinically relevant changes revealed that 80 families (20%) carried pathogenic variants in established XLID genes. In 19 families, we detected likely causative protein truncating and missense variants in 7 novel and validated XLID genes (CLCN4, CNKSR2, FRMPD4, KLHL15, LAS1L, RLIM and USP27X) and potentially deleterious variants in 2 novel candidate XLID genes (CDK16 and TAF1). We show that the CLCN4 and CNKSR2 variants impair protein functions as indicated by electrophysiological studies and altered differentiation of cultured primary neurons from Clcn4−/− mice or after mRNA knock-down. The newly identified and candidate XLID proteins belong to pathways and networks with established roles in cognitive function and intellectual disability in particular. We suggest that systematic sequencing of all X-chromosomal genes in a cohort of patients with genetic evidence for X-chromosome locus involvement may resolve up to 58% of Fragile X-negative cases.