Increasing evidence suggests the crucial role of estrogen in ovarian differentiation of nonmammalian vertebrates including fish. The present study has investigated the plausible role of Foxl2 in ovarian differentiation through transcriptional regulation of aromatase gene, using monosex fry of tilapia. Foxl2 expression is sexually dimorphic, like Cyp19a1, colocalizing with Cyp19a1 and Ad4BP/SF-1 in the stromal cells and interstitial cells in gonads of normal XX and sex-reversed XY fish, before the occurrence of morphological sex differentiation. Under in vitro conditions, Foxl2 binds to the sequence ACAAATA in the promoter region of the Cyp19a1 gene directly through its forkhead domain and activates the transcription of Cyp19a1 with its C terminus. Foxl2 can also interact through the forkhead domain with the ligand-binding domain of Ad4BP/SF-1 to form a heterodimer and enhance the Ad4BP/SF-1 mediated Cyp19a1 transcription. Disruption of endogenous Foxl2 in XX tilapia by overexpression of its dominant negative mutant (M3) induces varying degrees of testicular development with occasional sex reversal from ovary to testis. Such fish display reduced expression of Cyp19a1 as well as a drop in the serum levels of 17beta-estradiol and 11-ketotestosterone. Although the XY fish with wild-type tilapia Foxl2 (tFoxl2) overexpression never exhibited a complete sex reversal, there were significant structural changes, such as tissue degeneration, somatic cell proliferation, and induction of aromatase, with increased serum levels of 17beta-estradiol and 11-ketotestosterone. Altogether, these results suggest that Foxl2 plays a decisive role in the ovarian differentiation of the Nile tilapia by regulating aromatase expression and possibly the entire steroidogenic pathway.

Bovine cytochrome P-450(11 beta) gene (CYP11B) has six different cis-acting elements, Ad1, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, and Ad6, in the promoter region. The Ad4 site also exists in the promoter regions of other steroidogenic P-450 genes as well as in CYP11B1. An Ad4-binding protein (Ad4BP) which specifically binds to the Ad4 site was purified from bovine adrenal cortex nuclear extract, and its molecular mass was 53 kDa. A complementary DNA encoding Ad4BP was isolated from a bovine adrenal cortex cDNA library. The cDNA clone contained an open reading frame of 1383 base pairs encoding 461 amino acids, whose calculated molecular weight was 51,020. The predicted amino acid sequence of Ad4BP revealed that the protein has a zinc finger domain and a ligand binding/dimerization domain. Ad4BP is a novel member of the steroid hormone receptor superfamily. Comparison of the primary structures of the hormone receptor superfamily showed that Ad4BP was highly homologous to FTZ-F1, which regulates the fushi tarazu gene, and ELP, which is expressed in the murine embryonal carcinoma cells. Transfection of a Ad4BP expression plasmid into CV-1 cells activated the transcription of the CAT reporter gene carrying the Ad4 sequence in the promoter region.

Testosterone is a final product of androgenic hormone biosynthesis, and Leydig cells are known to be the primary source of androgens. In the mammalian testis, two distinct populations of Leydig cells, the fetal and the adult Leydig cells, develop sequentially, and these two cell types differ both morphologically and functionally. It is well known that the adult Leydig cells maintain male reproductive function by producing testosterone. However, it has been controversial whether fetal Leydig cells can produce testosterone, and the synthetic pathway of testosterone in the fetal testis is not fully understood. In the present study, we generated transgenic mice in which enhanced green fluorescence protein was expressed under the control of a fetal Leydig cell-specific enhancer of the Ad4BP/SF-1 (Nr5a1) gene. The transgene construct was prepared by mutating the LIM homeodomain transcription factor (LHX9)-binding sequence in the promoter, which abolished promoter activity in the undifferentiated testicular cells. These transgenic mice were used to collect highly pure fetal Leydig cells. Gene expression and steroidogenic enzyme activities in the fetal Leydig cells as well as in the fetal Sertoli cells and adult Leydig cells were analyzed. Our results revealed that the fetal Leydig cells synthesize only androstenedione because they lack expression of Hsd17b3, and fetal Sertoli cells convert androstenedione to testosterone, whereas adult Leydig cells synthesize testosterone by themselves. The current study demonstrated that both Leydig and Sertoli cells are required for testosterone synthesis in the mouse fetal testis.