EF
Emmanuelle Faure
Author with expertise in Innate Immune Recognition and Signaling Pathways
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
7
(100% Open Access)
Cited by:
3,734
h-index:
12
/
i10-index:
12
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

Decreased Expression of Toll-Like Receptor-4 and MD-2 Correlates with Intestinal Epithelial Cell Protection Against Dysregulated Proinflammatory Gene Expression in Response to Bacterial Lipopolysaccharide

María Abreu et al.Aug 1, 2001
Abstract The lumenal surface of the colonic epithelium is continually exposed to Gram-negative commensal bacteria and LPS. Recognition of LPS by Toll-like receptor (TLR)-4 results in proinflammatory gene expression in diverse cell types. Normally, however, commensal bacteria and their components do not elicit an inflammatory response from intestinal epithelial cells (IEC). The aim of this study is to understand the molecular mechanisms by which IEC limit chronic activation in the presence of LPS. Three IEC lines (Caco-2, T84, HT-29) were tested for their ability to activate an NF-κB reporter gene in response to purified, protein-free LPS. No IEC line responded to LPS, whereas human dermal microvessel endothelial cells (HMEC) did respond to LPS. IEC responded vigorously to IL-1β in this assay, demonstrating that the IL-1 receptor signaling pathway shared by TLRs was intact. To determine the reason for LPS hyporesponsiveness in IEC, we examined the expression of TLR4 and MD-2, a critical coreceptor for TLR4 signaling. IEC expressed low levels of TLR4 compared with HMEC and none expressed MD-2. To determine whether the low level of TLR4 expression or absent MD-2 was responsible for the LPS signaling defect in IEC, the TLR4 or MD-2 gene was transiently expressed in IEC lines. Transient transfection of either gene individually was not sufficient to restore LPS signaling, but cotransfection of TLR4 and MD-2 in IEC led to synergistic activation of NF-κB and IL-8 reporter genes in response to LPS. We conclude that IEC limit dysregulated LPS signaling by down-regulating expression of MD-2 and TLR4. The remainder of the intracellular LPS signaling pathway is functionally intact.
0
Citation669
0
Save
0

Toll-Like Receptor-4 Is Expressed by Macrophages in Murine and Human Lipid-Rich Atherosclerotic Plaques and Upregulated by Oxidized LDL

Xiao-Ou Xu et al.Dec 17, 2001
Background — Inflammation is implicated in atherogenesis and plaque disruption. Toll-like receptor 2 (TLR-2) and TLR-4, a human homologue of drosophila Toll, play an important role in the innate and inflammatory signaling responses to microbial agents. To investigate a potential role of these receptors in atherosclerosis, we assessed the expression of TLR-2 and TLR-4 in murine and human atherosclerotic plaques. Methods and Results — Aortic root lesions of high-fat diet-fed apoE-deficient mice (n=5) and human coronary atherosclerotic plaques (n=9) obtained at autopsy were examined for TLR-4 and TLR-2 expression by immunohistochemistry. Aortic atherosclerotic lesions in all apoE-deficient mice expressed TLR-4, whereas aortic tissue obtained from control C57BL/6J mice showed no TLR-4 expression. All 5 lipid-rich human plaques expressed TRL-4, whereas the 4 fibrous plaques and 4 normal human arteries showed no or minimal expression. Serial sections and double immunostaining showed TLR-4 colocalizing with macrophages both in murine atherosclerotic lesions and at the shoulder region of human coronary artery plaques. In contrast to TLR-4, none of the plaques expressed TLR-2. Furthermore, basal TLR-4 mRNA expression by human monocyte-derived macrophages was upregulated by ox-LDL in vitro. Conclusions — Our study demonstrates that TLR-4 is preferentially expressed by macrophages in murine and human lipid-rich atherosclerotic lesions, where it may play a role to enhance and sustain the innate immune and inflammatory responses. Moreover, upregulation of TLR-4 in macrophages by oxidized LDL suggests that TLR-4 may provide a potential pathophysiological link between lipids and infection/inflammation and atherosclerosis.
0

Bacterial Lipopolysaccharide Activates Nuclear Factor-κB through Interleukin-1 Signaling Mediators in Cultured Human Dermal Endothelial Cells and Mononuclear Phagocytes

Xiao Zhang et al.Mar 1, 1999
Bacterial lipopolysaccharide (LPS)-mediated immune responses, including activation of monocytes, macrophages, and endothelial cells, play an important role in the pathogenesis of Gram-negative bacteria-induced sepsis syndrome. Activation of NF-κB is thought to be required for cytokine release from LPS-responsive cells, a critical step for endotoxic effects. Here we investigated the role and involvement of interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF-α) signal transducer molecules in LPS signaling in human dermal microvessel endothelial cells (HDMEC) and THP-1 monocytic cells. LPS stimulation of HDMEC and THP-1 cells initiated an IL-1 receptor-like NF-κB signaling cascade. In transient cotransfection experiments, dominant negative mutants of the IL-1 signaling pathway, including MyD88, IRAK, IRAK2, and TRAF6 inhibited both IL-1- and LPS-induced NF-κB-luciferase activity. LPS-induced NF-κB activation was not inhibited by a dominant negative mutant of TRAF2 that is involved in TNF signaling. LPS-induced activation of NF-κB-responsive reporter gene was not inhibited by IL-1 receptor antagonist. TLR2 and TLR4 were expressed on the cell surface of HDMEC and THP-1 cells. These findings suggest that a signal transduction molecule in the LPS receptor complex may belong to the IL-1 receptor/toll-like receptor (TLR) super family, and the LPS signaling cascade uses an analogous molecular framework for signaling as IL-1 in mononuclear phagocytes and endothelial cells. Bacterial lipopolysaccharide (LPS)-mediated immune responses, including activation of monocytes, macrophages, and endothelial cells, play an important role in the pathogenesis of Gram-negative bacteria-induced sepsis syndrome. Activation of NF-κB is thought to be required for cytokine release from LPS-responsive cells, a critical step for endotoxic effects. Here we investigated the role and involvement of interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF-α) signal transducer molecules in LPS signaling in human dermal microvessel endothelial cells (HDMEC) and THP-1 monocytic cells. LPS stimulation of HDMEC and THP-1 cells initiated an IL-1 receptor-like NF-κB signaling cascade. In transient cotransfection experiments, dominant negative mutants of the IL-1 signaling pathway, including MyD88, IRAK, IRAK2, and TRAF6 inhibited both IL-1- and LPS-induced NF-κB-luciferase activity. LPS-induced NF-κB activation was not inhibited by a dominant negative mutant of TRAF2 that is involved in TNF signaling. LPS-induced activation of NF-κB-responsive reporter gene was not inhibited by IL-1 receptor antagonist. TLR2 and TLR4 were expressed on the cell surface of HDMEC and THP-1 cells. These findings suggest that a signal transduction molecule in the LPS receptor complex may belong to the IL-1 receptor/toll-like receptor (TLR) super family, and the LPS signaling cascade uses an analogous molecular framework for signaling as IL-1 in mononuclear phagocytes and endothelial cells. lipopolysaccharide human dermal microvessel endothelial cells interleukin-1 IL-1 receptor IL-1R accessory protein interleukin-6 IL-1 receptor-associated kinase myeloid differentiation protein nuclear factor-κB NF-κB-inducing kinase reverse transcription-polymerase chain reaction toll-like receptor tumor necrosis factor tumor necrosis factor receptor-associated factor polyacrylamide gel electrophoresis Lipopolysaccharide (LPS),1 or endotoxin, is the major component of the outer surface of Gram-negative bacteria. LPS is a potent activator of cells of the immune and inflammatory systems, including macrophages, monocytes, and endothelial cells, and contributes to systemic changes known as septic shock (1Wenzel R.P. Pinsky M.R. Ulevitch R.J. Young L. Clin. Infect. Dis. 1995; 22: 407-413Crossref Scopus (123) Google Scholar, 2Rietschel E.T. Brade H. Holst O. Brade L. Muller-Loennies S. Mamat U. Zähringer U. Beckmann F. Seydel U. Brandenburg K. Ulmer A.J. Mattern T. Heine H. Schletter J. Loppnow H. Schönbeck U. Flad H.-D. Hauschidt S. Schade U.F. Di Padova F. Kusumoto S. Schumann R.R. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996; 216: 40-81Google Scholar). LPS-induced activation of monocytes/macrophages is mediated through a cell surface receptor glycoprotein, known as membrane CD14 (mCD14). The binding of LPS to mCD14 is enhanced by LPS-binding protein, a plasma protein (3Ulevitch R.J. Tobias P.S. Curr. Opin. Immunol. 1994; 6: 125-130Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar). On the other hand, vascular endothelial cells do not express mCD14 and respond to LPS only in the presence of soluble CD14 (4Arditi M. Zhou J. Dorio R. Rong G.W. Goyert S.M. Kim K.S. Infect. Immun. 1993; 61: 3149-3156Crossref PubMed Google Scholar, 5Frey E.A. Miller D.S. Gullstein Jahr T. Sundan A. Bazil V. Espevik T. Finlay B.B. Wright S.D. J. Exp. Med. 1992; 176: 1665-1670Crossref PubMed Scopus (609) Google Scholar, 6Pugin J. Schurer-Maly C.-C. Leturcq D. Moriarty A. Ulevitch R.J. Tobias P.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 2744-2751Crossref PubMed Scopus (731) Google Scholar). We (7Arditi M. Zhou J. Torres M. Durden D.L. Stins M. Kim K.S. J. Immunol. 1995; 155: 3994-4003PubMed Google Scholar) and others (8Weinstein S.L. Gold M.R. DeFranco A.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 4148-4152Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar, 9Weinstein S.L. Sanghera J.S. Lemke K. DeFranco A.L. Pelech S.L. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14955-14962Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 10Reimann T. Büscher D. Hipskind R.A. Krautwald S. Lohmann-Matthes M.-L. Baccarini M. J. Immunol. 1994; 153: 5740-5749PubMed Google Scholar, 11Han J. Lee J.-D. Bibbs L. Ulevitch R.J. Science. 1994; 265: 808-811Crossref PubMed Scopus (2420) Google Scholar, 12Schumann R.R. Pfeil D. Lamping N. Kirschning C. Scherzinger G. Schlag P. Karawajew L. Herrmann F. Blood. 1996; 87: 2805-2814Crossref PubMed Google Scholar) have shown that protein tyrosine phosphorylation and activation of ERK1, ERK2, p38 mitogen-activated protein kinase, and c-Jun N-terminal kinase appear to be important for LPS-induced cellular activation. LPS rapidly induces nuclear factor-κB (NF-κB) in both monocytic (13Haeffner A. Thieblemont N. Deas O. Marelli O. Charpentier B. Senik A. Wright S.D. Haeffner-Cavaillon N. Hirsch F. J. Immunol. 1997; 158: 1310-1314PubMed Google Scholar, 14Cordle S.R. Donald R. Read M.A. Hawiger J. J. Biol. Chem. 1993; 268: 11803-11810Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) and endothelial cells (15Read M.A. Cordle S.R. Veach R.A. Carlisle C.D. Hawiger J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 9887-9891Crossref PubMed Scopus (121) Google Scholar). Activation of NF-κB is required for release of proinflammatory cytokines, including interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor (TNF) (16Baeuerle P.A. Baltimore D. Cell. 1996; 87: 13-20Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2935) Google Scholar, 17Baeuerle P.A. Curr. Biol. 1998; 8: R19-R22Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). However, the molecular mechanisms of the signaling cascade induced by LPS to activate NF-κB are unknown. Furthermore, the signaling LPS receptor is still unidentified. The toll gene controls dorsoventral pattern formation during the early embryonic development of Drosophila melanogaster (18Belvin M.P. Anderson K.V. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1996; 12: 393-416Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar). Toll initiates a signaling pathway homologous to the mammalian NF-κB activation cascade (18Belvin M.P. Anderson K.V. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1996; 12: 393-416Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar). The toll family of receptors is defined by homology to the Drosophila toll protein (19Chaudhary P.M. Ferguson C. Nguyen V. Blood. 1998; 91: 4020-4027Crossref PubMed Google Scholar, 20Heguy A. Baldari C.T. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The mammalian IL-1 receptor is a member of the toll family (18Belvin M.P. Anderson K.V. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1996; 12: 393-416Crossref PubMed Scopus (690) Google Scholar). Five other mammalian family members (toll-like receptors 1 through 5, TLR1–5) have been identified, but their function is uncertain. Several TLRs, similar to IL-1R, have been observed to signal through the NF-κB pathway (19Chaudhary P.M. Ferguson C. Nguyen V. Blood. 1998; 91: 4020-4027Crossref PubMed Google Scholar, 20Heguy A. Baldari C.T. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 21Rock F.L. Hardiman G. Timans J.C. Kastelein R.A. Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 588-593Crossref PubMed Scopus (1458) Google Scholar, 22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar). LPS signaling also leads to activation of NF-κB, and recent studies suggested that a toll-like receptor (TLR) might be a signaling receptor that is activated by LPS (22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar, 23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar). In these reports, expression of TLR2 in LPS-unresponsive human embryonic kidney cells (293 cells) enabled these cells to respond to LPS stimulation (22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar, 23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar). These investigators observed that LPS binds to a TLR2 extracellular domain and suggested that TLR2 is a candidate for a long sought LPS receptor, although the data were generated from a transfected and normally LPS-unresponsive cell line (22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar, 23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar). A recent study in the LPS-resistant C3H-HeJ mice has implicated another toll homologue (TLR4) as a signal-transducing component in the LPS receptor complex (24Kirschning C.J. Wesche H. Ayres T.M. Rothe M. J. Exp. Med. 1998; 188: 2091-2097Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar). It is known that the IL-1 signaling pathway in mammals is strikingly similar to the toll signaling pathway in Drosophila(19Chaudhary P.M. Ferguson C. Nguyen V. Blood. 1998; 91: 4020-4027Crossref PubMed Google Scholar, 20Heguy A. Baldari C.T. Macchia G. Telford J.L. Melli M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2605-2609Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 21Rock F.L. Hardiman G. Timans J.C. Kastelein R.A. Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 588-593Crossref PubMed Scopus (1458) Google Scholar, 22Medzhitov R. Preston-Hurlburt P. Janeway Jr., C.A. Nature. 1997; 388: 394-397Crossref PubMed Scopus (4458) Google Scholar). The molecular events linking the IL-1 receptor (IL-1R) signaling complex to the induction of NF-κB have been recently characterized. Upon binding of IL-1 to its receptors (IL-1R), IL-1R associates with the IL-1 receptor accessory protein (IL-1RAcP) (26Huang J. Gao X. Li S. Cao Z. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 12829-12832Crossref PubMed Scopus (195) Google Scholar,27Croston G.E. Cao Z. Goeddel D.V. J. Biol. Chem. 1995; 270: 16514-16517Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (154) Google Scholar). The complex then recruits and activates an adapter protein myeloid differentiation protein (MyD88) (28Wesche H. Henzel W.J. Shillinglaw W. Li W. Cao Z. Immunity. 1997; 7: 837-847Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (922) Google Scholar, 29Burns K. Martinon F. Esslinger C. Pahl H. Schneider P. Bodmer J.-L. Di Marco F. French L. Tschopp J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12203-12209Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (521) Google Scholar). MyD88 in turn recruits two distinct putative serine-threonine kinases, namely IL-1 receptor-activated kinase (IRAK) and IRAK2, to the receptor complex (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar). IRAK and IRAK2 interact subsequently with the adapter molecule, TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) (31Cao Z. Xiong J. Takeuchi M. Kurama T. Goeddel D.V. Science. 1996; 383: 443-446Google Scholar, 32Muzio M. Natoli G. Saccani S. Levrero M. Mantovani A. J. Exp. Med. 1998; 187: 2097-2101Crossref PubMed Scopus (527) Google Scholar), which links them to the protein kinase NF-κB-inducing kinase (NIK) (33Song H.Y. Regnier C.H. Kirschning C. Goeddel D.V. Cao Z. Rothe M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 9792-9796Crossref PubMed Scopus (506) Google Scholar). NIK activates the IκB kinase complex (IKKα and IKKβ) that directly phosphorylates IκB (34DiDonato J.A. Hayakawa M. Rothwarf D.M. Zandi E. Karin M. Nature. 1997; 388: 548-554Crossref PubMed Scopus (1917) Google Scholar, 35Stancovski I. Baltimore D. Cell. 1997; 91: 299-302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (456) Google Scholar, 36Scheidereit C. Nature. 1998; 395: 225-226Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar). The phosphorylation of IκB initiates ubiquitin-proteasome-mediated degradation and liberates and activates NF-κB (16Baeuerle P.A. Baltimore D. Cell. 1996; 87: 13-20Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2935) Google Scholar, 17Baeuerle P.A. Curr. Biol. 1998; 8: R19-R22Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). On the other hand, TNF and its receptor complex activate TRAF2, but not TRAF6 (37Rothe M. Sarma V. Dixit V.M. Goeddel D.V. Science. 1995; 269: 1421-1427Crossref Scopus (980) Google Scholar, 38Takeuchi M. Rothe M. Goeddel D.V. J. Biol. Chem. 1996; 271: 19935-19942Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (282) Google Scholar). Downstream signaling pathways of IL-1 and TNF distal to TRAF6 and TRAF2 converge (16Baeuerle P.A. Baltimore D. Cell. 1996; 87: 13-20Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2935) Google Scholar, 17Baeuerle P.A. Curr. Biol. 1998; 8: R19-R22Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar). In this study, we tested the hypothesis that LPS activates NF-κB through IL-1 signaling molecules, namely MyD88, IRAK, IRAK2, and TRAF6 in two LPS-responsive cell types. Dominant negative mutants of these signaling elements were transfected into human monocytes (THP-1 cells) and human dermal endothelial cells together with a NF-κB-responsive reporter gene, and LPS-induced NF-κB luciferase activity was measured. Our results indicate that LPS transduces signals of NF-κB activation utilizing the IL-1 signaling molecules in both monocytic and endothelial cells. Human THP-1 cells (from ATCC) were cultured in RPMI medium with 10% fetal calf serum. The immortalized human dermal endothelial cells (generous gift of Dr. Candal of the Center for Disease Control, Atlanta) were cultured in MCDB-131 medium with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 2 mm glutamine, and 100 μg/ml penicillin and streptomycin in 6-well plates. Dominant negative expression vectors of MyD88, IRAK, IRAK2, TRAF2, TRAF6, and NIK have been characterized and described before (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar, 32Muzio M. Natoli G. Saccani S. Levrero M. Mantovani A. J. Exp. Med. 1998; 187: 2097-2101Crossref PubMed Scopus (527) Google Scholar, 33Song H.Y. Regnier C.H. Kirschning C. Goeddel D.V. Cao Z. Rothe M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 9792-9796Crossref PubMed Scopus (506) Google Scholar). Cells were used for transfection with FuGene 6 Transfection Reagent (Boehringer Mannheim) following the manufacturer's instructions in RPMI with 10% serum. Reporter genes pCMV-β-galactosidase (0.5 μg) and ELAM-NF-κB-luciferase (2 μg) and pcDNA3 empty vector or dominant negative mutants of MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF2, and NIK (3 μg each) were used. After a 24-h transfection, cells were stimulated for 6 h with 100 ng/ml LPS. Cells were then lysed, and luciferase activity was measured with a Promega kit (Promega, Madison, WI) and a luminometer. β-Galactosidase activity was determined by the calorimetric method to normalize transfection efficiency as described earlier (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar). Data shown are means of two independent experiments. Transfection was carried out using the same method described above. The amount of NF-κB luciferase construct DNA was 1.5 μg, and empty vector and various dominant negative constructs were 2 μg each. Cells were transfected for 24 h and stimulated for 6 h with 100 ng/ml LPS, human TNF-α (200 units/ml, Genzyme, Cambridge, MA), recombinant human IL-1β (400 units/ml, Genzyme), and recombinant IL-1 receptor antagonist (100 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN) in 2 ml of serum-containing MCDB-131 medium. Total RNA was isolated from HDMEC and THP-1 cells using a Qiagen kit (Valencia, CA) and treated with RNase-free DNase I. For RT reaction, the SuperScriptTM Preamplification system (Life Technologies, Inc.) was applied. PCR amplification was performed withTaq polymerase (Qiagen, Valencia, CA) for 28 cycles at 95 °C for 40 s, 54 °C for 40 s, and 72 °C for 1 min. PCR primers for TLR2 were 5′-GCCAAAGTCTTGATTGATTGG and 5′-TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG. PCR primers for TLR4 were 5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG and 5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC. GAPDH primers were obtained from CLONTECH. Smeared THP-1 cell and cultured HDMEC on slides were fixed with acetone for 5 min and then stained with rabbit anti-TLR2 and TLR-4 antibody (1:100) and rabbit IgG following the instructions on a DACO immunostaining kit. The anti-TLR2 and anti-TLR4 antisera were raised against synthetic peptides (extracellular domains of TLR2 and TLR4) by BABCO (Richmond, CA). The sequence of the synthetic peptide for TLR2 was a 27-amino acid peptide, starting at amino acid residue 277 of the mature hTLR2 (FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR), whereas the peptide for TLR4 was a 23-amino acid peptide, starting at amino acid 201 of mature hTLR4 (FKEIRHKLTLRNNFDLSLNVMKT). Following immunoperoxidase staining, the representative fields were photographed. THP-1 and HDMEC cells were lysed in Laemmli buffer and separated with a 10% SDS-PAGE gel. The protein was then transferred onto a polyvinylidene difluoride membrane, and then the membrane was probed with anti-TLR2, anti-TLR4 antibodies, and prebleeds corresponding to each antibody (1:2,000). After incubation with horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibody, the membrane was developed with an enhanced chemiluminescence ECL detection kit. A series of defense mechanisms are triggered in vertebrates and invertebrates in response to Gram-negative bacterial infections by sensing the presence of LPS (1Wenzel R.P. Pinsky M.R. Ulevitch R.J. Young L. Clin. Infect. Dis. 1995; 22: 407-413Crossref Scopus (123) Google Scholar, 2Rietschel E.T. Brade H. Holst O. Brade L. Muller-Loennies S. Mamat U. Zähringer U. Beckmann F. Seydel U. Brandenburg K. Ulmer A.J. Mattern T. Heine H. Schletter J. Loppnow H. Schönbeck U. Flad H.-D. Hauschidt S. Schade U.F. Di Padova F. Kusumoto S. Schumann R.R. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1996; 216: 40-81Google Scholar, 3Ulevitch R.J. Tobias P.S. Curr. Opin. Immunol. 1994; 6: 125-130Crossref PubMed Scopus (229) Google Scholar). LPS-induced signal relay is thought to be initiated following its binding to specific cellular receptors which then triggers intracellular signaling pathways leading to the activation of NF-κB (4Arditi M. Zhou J. Dorio R. Rong G.W. Goyert S.M. Kim K.S. Infect. Immun. 1993; 61: 3149-3156Crossref PubMed Google Scholar, 5Frey E.A. Miller D.S. Gullstein Jahr T. Sundan A. Bazil V. Espevik T. Finlay B.B. Wright S.D. J. Exp. Med. 1992; 176: 1665-1670Crossref PubMed Scopus (609) Google Scholar, 6Pugin J. Schurer-Maly C.-C. Leturcq D. Moriarty A. Ulevitch R.J. Tobias P.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 2744-2751Crossref PubMed Scopus (731) Google Scholar, 7Arditi M. Zhou J. Torres M. Durden D.L. Stins M. Kim K.S. J. Immunol. 1995; 155: 3994-4003PubMed Google Scholar, 8Weinstein S.L. Gold M.R. DeFranco A.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 4148-4152Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar, 9Weinstein S.L. Sanghera J.S. Lemke K. DeFranco A.L. Pelech S.L. J. Biol. Chem. 1992; 267: 14955-14962Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 10Reimann T. Büscher D. Hipskind R.A. Krautwald S. Lohmann-Matthes M.-L. Baccarini M. J. Immunol. 1994; 153: 5740-5749PubMed Google Scholar, 11Han J. Lee J.-D. Bibbs L. Ulevitch R.J. Science. 1994; 265: 808-811Crossref PubMed Scopus (2420) Google Scholar, 12Schumann R.R. Pfeil D. Lamping N. Kirschning C. Scherzinger G. Schlag P. Karawajew L. Herrmann F. Blood. 1996; 87: 2805-2814Crossref PubMed Google Scholar) in various LPS-responsive cell types. To date, the identification of a functional, signal-transducing component of the putative LPS receptor complex and the signaling pathways involved in LPS-induced activation of NF-κB have remained elusive. Recent findings suggested that LPS might use signaling molecules of the TLR and IL-1R superfamilies to transduce signals (23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar, 24Kirschning C.J. Wesche H. Ayres T.M. Rothe M. J. Exp. Med. 1998; 188: 2091-2097Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar). To investigate the potential involvement of IL-1 and TNF signal transducers in LPS signaling in two LPS-responsive cell types, HDMEC and THP-1 cells, we cotransfected dominant negative constructs of various components of the NF-κB signaling cascades for IL-1 and TNF together with NF-κB-luciferase reporter gene. LPS induced the activation of NF-κB in a time- (Fig.1 A) and dose-dependent (Fig. 1 B) manner in THP-1 cells. Activation of NF-κB reached a maximum at a LPS concentration of 100 ng/ml and when cells were stimulated with LPS for 6 h (Fig. 1,A and B). Similar results were also obtained from endothelial cells. A mutant version of MyD88 (ΔMyD88), encoding only for the COOH-terminal toll-IL-1R-like domain, which abrogates IL-1R-induced NF-κB activation (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar), inhibited both LPS- and IL-1-mediated NF-κB activation (Figs. 1 C and 2, A and B) but not TNF-induced NF-κB activation (Fig.2 C). IRAK and IRAK-2 are two additional proximal mediators of the IL-1R signaling complex (30Muzio M. Ni J. Feng P. Dixit V.M. Science. 1997; 278: 1612-1615Crossref PubMed Scopus (988) Google Scholar). Dominant negative constructs of IRAK (ΔIRAK) and IRAK2 (ΔIRAK2) inhibited both LPS- (Figs. 1 D and 2 A) and IL-1R-mediated NF-κB activation (Fig. 2 B), but not TNF-induced NF-κB activation (Fig. 2 C). NF-κB activation induced by various cytokine receptors is mediated by members of the TRAF adapter family. While TRAF2 plays a crucial role in NF-κB activation by TNFR-1 and TNFR-2 (37Rothe M. Sarma V. Dixit V.M. Goeddel D.V. Science. 1995; 269: 1421-1427Crossref Scopus (980) Google Scholar, 38Takeuchi M. Rothe M. Goeddel D.V. J. Biol. Chem. 1996; 271: 19935-19942Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (282) Google Scholar), TRAF6 has been implicated in IL-1 signaling (31Cao Z. Xiong J. Takeuchi M. Kurama T. Goeddel D.V. Science. 1996; 383: 443-446Google Scholar, 32Muzio M. Natoli G. Saccani S. Levrero M. Mantovani A. J. Exp. Med. 1998; 187: 2097-2101Crossref PubMed Scopus (527) Google Scholar). Therefore, we next determined whether dominant negative versions of TRAF6 (ΔTRAF6) or TRAF2 (ΔTRAF2) could act to inhibit LPS-induced NF-κB activity. ΔTRAF-6 but not ΔTRAF2 significantly impaired LPS-induced NF-κB activation, suggesting that TRAF6 may act as an additional downstream mediator of LPS-induced NF-κB activation cascade (Figs. 1 D and2 A). ΔTRAF2 blocked TNF-induced NF-κB activation in endothelial cells (Fig. 2 C), but not LPS-induced NF-κB activation (Figs. 1 D and 2 A). Because the pathways for IL-1 and TNF-α signaling converge at the level of NIK for NF-κB activation, we next investigated whether dominant negative NIK mutant (ΔNIK) would block LPS-induced, as well as IL-1- and TNF-induced, NF-κB activation. As expected, ΔNIK blocked NF-κB activation induced by LPS, IL-1, and TNF-α (Fig. 2). IL-1 receptor antagonist had no effect on LPS-induced NF-κB activation (Fig. 2 A) but inhibited IL-1-induced NF-κB activation in endothelial cells (Fig. 2 B). This observation suggests that NF-κB activation that we measured following 6 h of LPS stimulation of cells is not due to an autocrine effect such as LPS-induced IL-1 release from endothelial cells. These data suggest that LPS stimulation of endothelial cells and THP-1 cells triggers an IL-1R-like signal relay leading to activation of NF-κB (Fig. 5). Further support for this concept is provided by the observation of a 15-year-old girl with recurrent infections who was found to be resistant to both LPS and IL-1 stimulation in vivo and in vitro (39Kuhns D.B. Long Priel D.A. Gallin J.I. J. Immunol. 1997; 158: 3959-3964PubMed Google Scholar). The authors suggested that resistance to LPS and IL-1 was due to a defect very early in the common signaling pathway for LPS and IL-1 (39Kuhns D.B. Long Priel D.A. Gallin J.I. J. Immunol. 1997; 158: 3959-3964PubMed Google Scholar). The experiments with IL-1R antagonist also suggest that LPS does not use IL-1 receptor to transduce signals in endothelial cells. Although recent findings imply that TLR2 or other members of the TLR family, which use the IL-1R signaling pathway, might be an important mediator for LPS signaling (23Yang R.-B. Mark M.R. Gray A. Huang A. Xie M.H. Zhang M. Goddard A. Wood W.I. Gurney A.L. Godowski P.J. Nature. 1998; 395: 284-288Crossref PubMed Scopus (1102) Google Scholar, 24Kirschning C.J. Wesche H. Ayres T.M. Rothe M. J. Exp. Med. 1998; 188: 2091-2097Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar), further studies are needed to identify naturally existing LPS receptors in LPS-responsive cells. Beutler and coworkers (25Poltorak A. He X. Smirnova I. Liu M.-Y. Van Huffel C. Du X. Birdwell D. Alejos E. Silva M. Galanos C. Freudenberg M. Ricciardi-Castagnoli P. Layton B. Beutler B. Science. 1998; 282: 2085-2088Crossref PubMed Scopus (6478) Google Scholar) recently reported that TLR4 is the protein encoded by the LPS gene, which is mutated in the LPS-non-responsive C3H-HeJ mice. To investigate the expression of the TLR2 and TLR4 message in HDMEC and THP-1 cells, we used RT-PCR. Human THP-1 and HDMEC were found to express significant levels of both TLR2 and TLR4 mRNA (Fig.3). Expression levels of TLR2 appeared to be stronger in THP-1 whereas the expression level of TLR4 appeared to be stronger in HDMEC. Expression of TLR2 and TLR4 was confirmed with Northern analysis in THP-1 cells. Immunohistochemistry and immunoblotting data demonstrate that TLR2 and TLR4 proteins are expressed on THP-1 cells and HDMEC (Fig.4). Staining was absent in THP-1 and HDMEC incubated without the first antibody or incubated with rabbit IgG. These results suggest that TLR2 and TLR4 are expressed in endothelial and monocytic cells and may represent a signaling component of a cellular receptor for LPS which signals through an IL-1-like pathway (Fig. 5).Figure 4Immunostaining and immunoblotting. Inpanel A, THP-1 cells (a, c, and e) and HDMEC cells (b, d, andf) were immunostained with rabbit IgG (a andb), anti-TLR2 (c and d), and anti-TLR4 (e and f) (1:100). In panel B, THP-1 and HDMEC cell lysates were resolved with SDS-PAGE and probed with anti-TLR2, anti-TLR4 antibodies, and corresponding prebleeds. Molecular mass markers are indicated at theright. The apparent molecular masses for TLR2 and TLR4 were 85 kDa and 92 kDa, respectively.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) In summary, we have demonstrated in endothelial and THP-1 cells that LPS-induced NF-κB activation is mediated by IL-1R signaling molecules, namely MyD88, IRAK, IRAK2, and TRAF6, but not the TNF signaling molecule, TRAF2. We have also shown that TLR2 and TLR4 are expressed on the cell surface of two LPS-responsive cell types, endothelial cells and THP-1 cells. These data strongly suggest that a crucial signaling component in the LPS receptor complex may belong to the IL-1 receptor/TLR superfamily, and the LPS signaling cascade uses an analogous molecular framework for signaling as IL-1. MyD88 appears to represent the most upstream mediator of the LPS-mediated signaling cascade, which ultimately activates NF-κB, thus driving transcriptional activation of several cytokines. Thus, MyD88 may represent a potentially useful therapeutic target to control the molecular switch from innate to the adaptive immune response.
0
Citation608
0
Save
0

Bacterial Lipopolysaccharide Activates NF-κB through Toll-like Receptor 4 (TLR-4) in Cultured Human Dermal Endothelial Cells

Emmanuelle Faure et al.Apr 1, 2000
A missense mutation in the cytoplasmic domain of the Toll-like receptor-4 (TLR-4) has been identified as the defect responsible for lipopolysaccharide (LPS) hyporesponsiveness in C3H/HeJ mice. TLR-4 and TLR-2 have recently been implicated in LPS signaling in studies where these receptors were overexpressed in LPS non-responsive 293 human embryonic kidney cells. However, the signaling role of TLR-4 or TLR-2 in human cells with natural LPS response remains largely undefined. Here we show that human dermal microvessel endothelial cells (HMEC) and human umbilical vein endothelial cells express predominantly TLR-4 but very weak TLR-2 and respond vigorously to LPS but not toMycobacterium tuberculosis 19-kDa lipoprotein. Transient transfection of non-signaling mutant forms of TLR-4 and anti-TLR-4 monoclonal antibody inhibited LPS-induced NF-κB activation in HMEC, while a monoclonal antibody against TLR-2 was ineffective. In contrast to LPS responsiveness, the ability of HMEC to respond to 19-kDa lipoprotein correlated with the expression of TLR-2. Transfection of TLR-2 into HMEC conferred responsiveness to 19-kDa lipoprotein. These data indicate that TLR-4 is the LPS signaling receptor in HMEC and that human endothelial cells (EC) express predominantly TLR-4 and weak TLR-2, which may explain why they do not respond to 19-kDa lipoprotein. The differential expression of TLRs on human EC may have important implications in the participation of vascular EC in innate immune defense mechanisms against various infectious pathogens, which may use different TLRs to signal.
0
Citation552
0
Save
0

Bacterial Lipopolysaccharide and IFN-γ Induce Toll-Like Receptor 2 and Toll-Like Receptor 4 Expression in Human Endothelial Cells: Role of NF-κB Activation

Emmanuelle Faure et al.Feb 1, 2001
Abstract Toll-like receptor (TLR) 4 has been identified as the primary receptor for enteric LPS, whereas TLR2 has been implicated as the receptor for Gram-positive and fungal cell wall components and for bacterial, mycobacterial, and spirochetal lipoproteins. Vascular endothelial cell (EC) activation or injury by microbial cell wall components such as LPS is of critical importance in the development of sepsis and septic shock. We have previously shown that EC express predominantly TLR4, and have very little TLR2. These cells respond vigorously to LPS via TLR4, but are unresponsive to lipoproteins and other TLR2 ligands. Here we show that LPS, TNF-α, or IFN-γ induce TLR2 expression in both human dermal microvessel EC and HUVEC. Furthermore, LPS and IFN-γ act synergistically to induce TLR2 expression in EC, and LPS-induced TLR2 expression is NF-κB dependent. LPS and IFN-γ also up-regulate TLR4 mRNA expression in EC. These data indicate that TLR2 and TLR4 expression in ECs is regulated by inflammatory molecules such as LPS, TNF-α, or IFN-γ. TLR2 and TLR4 molecules may render EC responsive to TLR2 ligands and may help to explain the synergy between LPS and lipoproteins, and between LPS and IFN-γ, in inducing shock associated with Gram-negative sepsis.
0

Chlamydial Heat Shock Protein 60 Activates Macrophages and Endothelial Cells Through Toll-Like Receptor 4 and MD2 in a MyD88-Dependent Pathway

Yonca Bulut et al.Feb 1, 2002
Abstract Active inflammation and NF-κB activation contribute fundamentally to atherogenesis and plaque disruption. Accumulating evidence has implicated specific infectious agents including Chlamydia pneumoniae in the progression of atherogenesis. Chlamydial heat shock protein 60 (cHSP60) has been implicated in the induction of deleterious immune responses in human chlamydial infections and has been found to colocalize with infiltrating macrophages in atheroma lesions. cHSP60 might stimulate, enhance, and maintain innate immune and inflammatory responses and contribute to atherogenesis. In this study, we investigated the signaling mechanism of cHSP60. Recombinant cHSP60 rapidly activated NF-κB in human microvascular endothelial cells (EC) and in mouse macrophages, and induced human IL-8 promoter activity in EC. The inflammatory effect of cHSP60 was heat labile, thus excluding a role of contaminating LPS, and was blocked by specific anti-chlamydial HSP60 mAb. In human vascular EC which express Toll-like receptor 4 (TLR4) mRNA and protein, nonsignaling TLR4 constructs that act as dominant negative blocked cHSP60-mediated NF-κB activation. Furthermore, an anti-TLR4 Ab abolished cHSP60-induced cellular activation, whereas a control Ab had no effect. In 293 cells, cHSP60-mediated NF-κB activation required both TLR4 and MD2. A dominant-negative MyD88 construct also inhibited cHSP60-induced NF-κB activation. Collectively, our results indicate that cHSP60 is a potent inducer of vascular EC and macrophage inflammatory responses, which are very relevant to atherogenesis. The inflammatory effects are mediated through the innate immune receptor complex TLR4-MD2 and proceeds via the MyD88-dependent signaling pathway. These findings may help elucidate the mechanisms by which chronic asymptomatic chlamydial infection contribute to atherogenesis.
0
Citation415
0
Save
0

Cooperation of Toll-Like Receptor 2 and 6 for Cellular Activation by Soluble Tuberculosis Factor andBorrelia burgdorferiOuter Surface Protein A Lipoprotein: Role of Toll-Interacting Protein and IL-1 Receptor Signaling Molecules in Toll-Like Receptor 2 Signaling

Yonca Bulut et al.Jul 15, 2001
Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 play important roles in innate immune responses to various microbial agents. We have previously shown that human dermal endothelial cells (HMEC) express TLR4, but very little TLR2, and respond to LPS, but not to Mycobacterium tuberculosis 19-kDa lipoprotein, unless transfected with TLR2. Here we report that HMEC are unresponsive to several additional biologically relevant TLR2 ligands, including, phenol-soluble modulin (PSM), a complex of three small secreted polypeptides from the skin commensal Staphylococcus epidermidis, soluble tuberculosis factor (STF), and Borrelia burgdorferi outer surface protein A lipoprotein (OspA-L). Expression of TLR2 renders HMEC responsive to all these ligands. We further characterized the signaling pathway in response to STF, OspA-L, and PSM in TLR2-transfected HMEC. The TLR2 signaling pathway for NF-kappaB trans-activation shares the IL-1R signaling molecules. Dominant negative constructs of TLR2 or TLR6 inhibit the responses of STF and OspA-L as well as PSM in TLR2-transfected HMEC, supporting the concept of functional cooperation between TLR2 and TLR6 for all these TLR2 ligands. Moreover, we show that Toll-interacting protein (Tollip) coimmunoprecipitates with TLR2 and TLR4 using HEK 293 cells, and overexpression of Tollip inhibits NF-kappaB activation in response to TLR2 and TLR4 signaling. Collectively, these findings suggest that there is functional interaction between TLR2 and TLR6 in the cellular response to STF and OspA-L in addition to S. epidermidis (PSM) Ags, and that engagement of TLR2 triggers a signaling cascade, which shares the IL-1R signaling molecules, similar to the TLR4-LPS signaling cascade. Our data also suggest that Tollip may be an important constituent of both the TLR2 and TLR4 signaling pathways.