Healthy Research Rewards
ResearchHub is incentivizing healthy research behavior. At this time, first authors of open access papers are eligible for rewards. Visit the publications tab to view your eligible publications.
Got it
TK
Takafumi Kohama
Author with expertise in Mechanisms of Intracellular Membrane Trafficking
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
3
(100% Open Access)
Cited by:
1,699
h-index:
30
/
i10-index:
47
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

Molecular Cloning and Functional Characterization of a Novel Mammalian Sphingosine Kinase Type 2 Isoform

Hong Liu et al.Jun 1, 2000
Sphingosine-1-phosphate (SPP) has diverse biological functions acting inside cells as a second messenger to regulate proliferation and survival, and extracellularly, as a ligand for G protein-coupled receptors of the endothelial differentiation gene-1 subfamily. Based on sequence homology to murine and human sphingosine kinase-1 (SPHK1), which we recently cloned (Kohama, T., Oliver, A., Edsall, L., Nagiec, M. M., Dickson, R., and Spiegel, S. (1998) J. Biol. Chem. 273, 23722–23728), we have now cloned a second type of mouse and human sphingosine kinase (mSPHK2 and hSPHK2). mSPHK2 and hSPHK2 encode proteins of 617 and 618 amino acids, respectively, both much larger than SPHK1, and though diverging considerably, both contain the conserved domains found in all SPHK1s. Northern blot analysis revealed that SPHK2 mRNA expression had a strikingly different tissue distribution from that of SPHK1 and appeared later in embryonic development. Expression of SPHK2 in HEK 293 cells resulted in elevated SPP levels. d-erythro-dihydrosphingosine was a better substrate than d-erythro-sphingosine for SPHK2. Surprisingly, d,l-threo-dihydrosphingosine was also phosphorylated by SPHK2. In contrast to the inhibitory effects on SPHK1, high salt concentrations markedly stimulated SPHK2. Triton X-100 inhibited SPHK2 and stimulated SPHK1, whereas phosphatidylserine stimulated both type 1 and type 2 SPHK. Thus, SPHK2 is another member of a growing class of sphingolipid kinases that may have novel functions.
0

Molecular Cloning and Functional Characterization of Murine Sphingosine Kinase

Takafumi Kohama et al.Sep 1, 1998
Sphingosine-1-phosphate (SPP) is a novel lipid messenger that has dual function. Intracellularly it regulates proliferation and survival, and extracellularly, it is a ligand for the G protein-coupled receptor Edg-1. Based on peptide sequences obtained from purified rat kidney sphingosine kinase, the enzyme that regulates SPP levels, we report here the cloning, identification, and characterization of the first mammalian sphingosine kinases (murine SPHK1a and SPHK1b). Sequence analysis indicates that these are novel kinases, which are not similar to other known kinases, and that they are evolutionarily conserved. Comparison withSaccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans sphingosine kinase sequences shows that several blocks are highly conserved in all of these sequences. One of these blocks contains an invariant, positively charged motif, GGKGK, which may be part of the ATP binding site. From Northern blot analysis of multiple mouse tissues, we observed that expression was highest in adult lung and spleen, with barely detectable levels in skeletal muscle and liver. Human embryonic kidney cells and NIH 3T3 fibroblasts transiently transfected with either sphingosine kinase expression vectors had marked increases (more than 100-fold) in sphingosine kinase activity. The enzyme specifically phosphorylatedd-erythro-sphingosine and did not catalyze the phosphorylation of phosphatidylinositol, diacylglycerol, ceramide,d,l-threo-dihydrosphingosine orN, N-dimethylsphingosine. The latter two sphingolipids were competitive inhibitors of sphingosine kinase in the transfected cells as was previously found with the purified rat kidney enzyme. Transfected cells also had a marked increase in mass levels of SPP with a concomitant decrease in levels of sphingosine and, to a lesser extent, in ceramide levels. Our data suggest that sphingosine kinase is a prototypical member of a new class of lipid kinases. Cloning of sphingosine kinase is an important step in corroborating the intracellular role of SPP as a second messenger. Sphingosine-1-phosphate (SPP) is a novel lipid messenger that has dual function. Intracellularly it regulates proliferation and survival, and extracellularly, it is a ligand for the G protein-coupled receptor Edg-1. Based on peptide sequences obtained from purified rat kidney sphingosine kinase, the enzyme that regulates SPP levels, we report here the cloning, identification, and characterization of the first mammalian sphingosine kinases (murine SPHK1a and SPHK1b). Sequence analysis indicates that these are novel kinases, which are not similar to other known kinases, and that they are evolutionarily conserved. Comparison withSaccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans sphingosine kinase sequences shows that several blocks are highly conserved in all of these sequences. One of these blocks contains an invariant, positively charged motif, GGKGK, which may be part of the ATP binding site. From Northern blot analysis of multiple mouse tissues, we observed that expression was highest in adult lung and spleen, with barely detectable levels in skeletal muscle and liver. Human embryonic kidney cells and NIH 3T3 fibroblasts transiently transfected with either sphingosine kinase expression vectors had marked increases (more than 100-fold) in sphingosine kinase activity. The enzyme specifically phosphorylatedd-erythro-sphingosine and did not catalyze the phosphorylation of phosphatidylinositol, diacylglycerol, ceramide,d,l-threo-dihydrosphingosine orN, N-dimethylsphingosine. The latter two sphingolipids were competitive inhibitors of sphingosine kinase in the transfected cells as was previously found with the purified rat kidney enzyme. Transfected cells also had a marked increase in mass levels of SPP with a concomitant decrease in levels of sphingosine and, to a lesser extent, in ceramide levels. Our data suggest that sphingosine kinase is a prototypical member of a new class of lipid kinases. Cloning of sphingosine kinase is an important step in corroborating the intracellular role of SPP as a second messenger. sphingosine-1-phosphate high performance liquid chromatography. The sphingolipid metabolite, sphingosine-1-phosphate (SPP),1 is emerging as a prototype of a new class of lipid second messengers, which has both intracellular and extracellular actions (1Olivera A. Spiegel S. Nature. 1993; 365: 557-560Crossref PubMed Scopus (810) Google Scholar, 2Meyer zu Heringdorf D. Lass H. Alemany R. Laser K.T. Neumann E. Zhang C. Schmidt M. Rauen U. Jakobs K.H. van Koppen C.J. EMBO J. 1998; 17: 2830-2837Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar, 3Cuvillier O. Pirianov G. Kleuser B. Vanek P.G. Coso O.A. Gutkind S. Spiegel S. Nature. 1996; 381: 800-803Crossref PubMed Scopus (1337) Google Scholar, 4Lee M.-J. Van Brocklyn J.R. Thangada S. Liu C.H. Hand A.R. Menzeleev R. Spiegel S. Hla T. Science. 1998; 279: 1552-1555Crossref PubMed Scopus (881) Google Scholar). Ample evidence indicates that SPP can serve as an intracellular second messenger; SPP modulates intracellular pathways important for diverse biological processes including cell growth, survival, motility, and cytoskeletal changes (reviewed in Ref. 5Spiegel S. Foster D. Kolesnick R. Curr. Opin. Cell Biol. 1996; 8: 159-167Crossref PubMed Scopus (471) Google Scholar). Moreover, because SPP antagonizes apoptosis mediated by ceramide, a stress-induced sphingolipid metabolite (3Cuvillier O. Pirianov G. Kleuser B. Vanek P.G. Coso O.A. Gutkind S. Spiegel S. Nature. 1996; 381: 800-803Crossref PubMed Scopus (1337) Google Scholar, 6Edsall L.C. Pirianov G.G. Spiegel S. J. Neurosci. 1997; 17: 6952-6960Crossref PubMed Google Scholar), we have proposed that the relative intracellular levels of these two sphingolipid metabolites is an important factor that determines whether cells will survive or die (3Cuvillier O. Pirianov G. Kleuser B. Vanek P.G. Coso O.A. Gutkind S. Spiegel S. Nature. 1996; 381: 800-803Crossref PubMed Scopus (1337) Google Scholar). In support of this idea, it has recently been shown that unfertilized mouse oocytes exposed to the anticancer drug doxorubicin undergo ceramide-mediated apoptosis that is inhibited by SPP (7Perez G.I. Knudson C.M. Leykin L. Korsmeyer S.J. Tilly J.L. Nat. Med. 1997; 3: 1228-1232Crossref PubMed Scopus (307) Google Scholar). In addition, it seems that this ceramide/SPP rheostat is an evolutionarily conserved stress regulatory mechanism influencing growth and survival of yeast (8Mandala S. Thornton R. Tu Z. Kurtz M. Nickels J. Broach J. Menzeleev R. Spiegel S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 150-155Crossref PubMed Scopus (235) Google Scholar, 9Jenkins G.M. Richards A. Wahl T. Mao C. Obeid L. Hannun Y. J. Biol. Chem. 1997; 272: 32566-32572Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (256) Google Scholar, 10Dickson R.C. Nagiec E.E. Skrzypek M. Tillman P. Wells G.B. Lester R.L. J. Biol. Chem. 1997; 272: 30196-30200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (218) Google Scholar). Recently, it has been shown that SPP, a serum borne lipid, is the ligand for the G protein-coupled endothelial-derived receptor-1 (EDG-1), which regulates morphogenetic differentiation of endothelial cells (4Lee M.-J. Van Brocklyn J.R. Thangada S. Liu C.H. Hand A.R. Menzeleev R. Spiegel S. Hla T. Science. 1998; 279: 1552-1555Crossref PubMed Scopus (881) Google Scholar). Taken together, these data suggest that SPP has dual actions (11Van Brocklyn J.R. Lee M.J. Menzeleev R. Olivera A. Edsall L. Cuvillier O. Dianne M.T. Coopman P.J.P. Thangada S. Hla T. Spiegel S. J. Cell Biol. 1998; 142: 229-240Crossref PubMed Scopus (445) Google Scholar).Various stimuli, including platelet-derived growth factor and serum (1Olivera A. Spiegel S. Nature. 1993; 365: 557-560Crossref PubMed Scopus (810) Google Scholar,12Bornfeldt K.E. Graves L.M. Raines E.W. Igarashi Y. Wayman G. Yamamura S. Yatomi Y. Sidhu J.S. Krebs E.G. Hakomori S. Ross R. J. Cell Biol. 1995; 130: 193-206Crossref PubMed Scopus (264) Google Scholar), nerve growth factor (6Edsall L.C. Pirianov G.G. Spiegel S. J. Neurosci. 1997; 17: 6952-6960Crossref PubMed Google Scholar, 13Rius R.A. Edsall L.C. Spiegel S. FEBS Lett. 1997; 417: 173-176Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar), activation of protein kinase C (14Mazurek N. Megidish T. Hakomori S.-I. Igarashi Y. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994; 198: 1-9Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar,15Buehrer B.M. Bardes E.S. Bell R.M. Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1303: 233-242Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar), and cross-linking of FcεR1 and FcγR1 (16Melendez A. Floto R.A. Gillooly D.J. Harnett M.M. Allen J.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 9393-9402Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar), increase cellular levels of SPP by activation of sphingosine kinase, the enzyme that catalyzes the phosphorylation of sphingosine. Competitive inhibitors of sphingosine kinase block formation of SPP and selectively inhibit cellular proliferation induced by platelet-derived growth factor and serum (1Olivera A. Spiegel S. Nature. 1993; 365: 557-560Crossref PubMed Scopus (810) Google Scholar, 17Rani C.S. Wang F. Fuior E. Berger A. Wu J. Sturgill T.W. Beitner-Johnson D. LeRoith D. Varticovski L. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1997; 272: 10777-10783Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (120) Google Scholar), the cytoprotective effects of protein kinase C (3Cuvillier O. Pirianov G. Kleuser B. Vanek P.G. Coso O.A. Gutkind S. Spiegel S. Nature. 1996; 381: 800-803Crossref PubMed Scopus (1337) Google Scholar), and nerve growth factor (6Edsall L.C. Pirianov G.G. Spiegel S. J. Neurosci. 1997; 17: 6952-6960Crossref PubMed Google Scholar), as well as FcεRI- and FcγR1-mediated calcium signaling (16Melendez A. Floto R.A. Gillooly D.J. Harnett M.M. Allen J.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 9393-9402Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar), further supporting a role for endogenous SPP in cell growth, survival, and calcium mobilization.Collectively, these results give new insights into the biological function of SPP and emphasize the importance of sphingosine kinase, the enzyme that regulates its formation. Recently, we have purified rat kidney sphingosine kinase 6 Ã— 105-fold to apparent homogeneity (18Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (201) Google Scholar). Purified sphingosine kinase has an apparent molecular mass of approximately 49 kDa with K m values of 5 and 93 Î¼m for sphingosine and ATP, respectively (18Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (201) Google Scholar). Based on peptide sequences, we report here the cloning and characterization of the first mammalian sphingosine kinases. The sphingolipid metabolite, sphingosine-1-phosphate (SPP),1 is emerging as a prototype of a new class of lipid second messengers, which has both intracellular and extracellular actions (1Olivera A. Spiegel S. Nature. 1993; 365: 557-560Crossref PubMed Scopus (810) Google Scholar, 2Meyer zu Heringdorf D. Lass H. Alemany R. Laser K.T. Neumann E. Zhang C. Schmidt M. Rauen U. Jakobs K.H. van Koppen C.J. EMBO J. 1998; 17: 2830-2837Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar, 3Cuvillier O. Pirianov G. Kleuser B. Vanek P.G. Coso O.A. Gutkind S. Spiegel S. Nature. 1996; 381: 800-803Crossref PubMed Scopus (1337) Google Scholar, 4Lee M.-J. Van Brocklyn J.R. Thangada S. Liu C.H. Hand A.R. Menzeleev R. Spiegel S. Hla T. Science. 1998; 279: 1552-1555Crossref PubMed Scopus (881) Google Scholar). Ample evidence indicates that SPP can serve as an intracellular second messenger; SPP modulates intracellular pathways important for diverse biological processes including cell growth, survival, motility, and cytoskeletal changes (reviewed in Ref. 5Spiegel S. Foster D. Kolesnick R. Curr. Opin. Cell Biol. 1996; 8: 159-167Crossref PubMed Scopus (471) Google Scholar). Moreover, because SPP antagonizes apoptosis mediated by ceramide, a stress-induced sphingolipid metabolite (3Cuvillier O. Pirianov G. Kleuser B. Vanek P.G. Coso O.A. Gutkind S. Spiegel S. Nature. 1996; 381: 800-803Crossref PubMed Scopus (1337) Google Scholar, 6Edsall L.C. Pirianov G.G. Spiegel S. J. Neurosci. 1997; 17: 6952-6960Crossref PubMed Google Scholar), we have proposed that the relative intracellular levels of these two sphingolipid metabolites is an important factor that determines whether cells will survive or die (3Cuvillier O. Pirianov G. Kleuser B. Vanek P.G. Coso O.A. Gutkind S. Spiegel S. Nature. 1996; 381: 800-803Crossref PubMed Scopus (1337) Google Scholar). In support of this idea, it has recently been shown that unfertilized mouse oocytes exposed to the anticancer drug doxorubicin undergo ceramide-mediated apoptosis that is inhibited by SPP (7Perez G.I. Knudson C.M. Leykin L. Korsmeyer S.J. Tilly J.L. Nat. Med. 1997; 3: 1228-1232Crossref PubMed Scopus (307) Google Scholar). In addition, it seems that this ceramide/SPP rheostat is an evolutionarily conserved stress regulatory mechanism influencing growth and survival of yeast (8Mandala S. Thornton R. Tu Z. Kurtz M. Nickels J. Broach J. Menzeleev R. Spiegel S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 150-155Crossref PubMed Scopus (235) Google Scholar, 9Jenkins G.M. Richards A. Wahl T. Mao C. Obeid L. Hannun Y. J. Biol. Chem. 1997; 272: 32566-32572Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (256) Google Scholar, 10Dickson R.C. Nagiec E.E. Skrzypek M. Tillman P. Wells G.B. Lester R.L. J. Biol. Chem. 1997; 272: 30196-30200Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (218) Google Scholar). Recently, it has been shown that SPP, a serum borne lipid, is the ligand for the G protein-coupled endothelial-derived receptor-1 (EDG-1), which regulates morphogenetic differentiation of endothelial cells (4Lee M.-J. Van Brocklyn J.R. Thangada S. Liu C.H. Hand A.R. Menzeleev R. Spiegel S. Hla T. Science. 1998; 279: 1552-1555Crossref PubMed Scopus (881) Google Scholar). Taken together, these data suggest that SPP has dual actions (11Van Brocklyn J.R. Lee M.J. Menzeleev R. Olivera A. Edsall L. Cuvillier O. Dianne M.T. Coopman P.J.P. Thangada S. Hla T. Spiegel S. J. Cell Biol. 1998; 142: 229-240Crossref PubMed Scopus (445) Google Scholar). Various stimuli, including platelet-derived growth factor and serum (1Olivera A. Spiegel S. Nature. 1993; 365: 557-560Crossref PubMed Scopus (810) Google Scholar,12Bornfeldt K.E. Graves L.M. Raines E.W. Igarashi Y. Wayman G. Yamamura S. Yatomi Y. Sidhu J.S. Krebs E.G. Hakomori S. Ross R. J. Cell Biol. 1995; 130: 193-206Crossref PubMed Scopus (264) Google Scholar), nerve growth factor (6Edsall L.C. Pirianov G.G. Spiegel S. J. Neurosci. 1997; 17: 6952-6960Crossref PubMed Google Scholar, 13Rius R.A. Edsall L.C. Spiegel S. FEBS Lett. 1997; 417: 173-176Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar), activation of protein kinase C (14Mazurek N. Megidish T. Hakomori S.-I. Igarashi Y. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994; 198: 1-9Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar,15Buehrer B.M. Bardes E.S. Bell R.M. Biochim. Biophys. Acta. 1996; 1303: 233-242Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar), and cross-linking of FcεR1 and FcγR1 (16Melendez A. Floto R.A. Gillooly D.J. Harnett M.M. Allen J.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 9393-9402Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar), increase cellular levels of SPP by activation of sphingosine kinase, the enzyme that catalyzes the phosphorylation of sphingosine. Competitive inhibitors of sphingosine kinase block formation of SPP and selectively inhibit cellular proliferation induced by platelet-derived growth factor and serum (1Olivera A. Spiegel S. Nature. 1993; 365: 557-560Crossref PubMed Scopus (810) Google Scholar, 17Rani C.S. Wang F. Fuior E. Berger A. Wu J. Sturgill T.W. Beitner-Johnson D. LeRoith D. Varticovski L. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1997; 272: 10777-10783Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (120) Google Scholar), the cytoprotective effects of protein kinase C (3Cuvillier O. Pirianov G. Kleuser B. Vanek P.G. Coso O.A. Gutkind S. Spiegel S. Nature. 1996; 381: 800-803Crossref PubMed Scopus (1337) Google Scholar), and nerve growth factor (6Edsall L.C. Pirianov G.G. Spiegel S. J. Neurosci. 1997; 17: 6952-6960Crossref PubMed Google Scholar), as well as FcεRI- and FcγR1-mediated calcium signaling (16Melendez A. Floto R.A. Gillooly D.J. Harnett M.M. Allen J.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 9393-9402Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar), further supporting a role for endogenous SPP in cell growth, survival, and calcium mobilization. Collectively, these results give new insights into the biological function of SPP and emphasize the importance of sphingosine kinase, the enzyme that regulates its formation. Recently, we have purified rat kidney sphingosine kinase 6 Ã— 105-fold to apparent homogeneity (18Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (201) Google Scholar). Purified sphingosine kinase has an apparent molecular mass of approximately 49 kDa with K m values of 5 and 93 Î¼m for sphingosine and ATP, respectively (18Olivera A. Kohama T. Tu Z. Milstien S. Spiegel S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 12576-12583Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (201) Google Scholar). Based on peptide sequences, we report here the cloning and characterization of the first mammalian sphingosine kinases. We thank Drs. Alexander Yakovlev, James R. Van Brocklyn, Tom I. Bonner, Sheldon Milstien, and Masaaki Takahashi for helpful suggestions and Dr. Barry W. Cherney for assistance with Northern assays.
0

Sphingosine Kinase Expression Increases Intracellular Sphingosine-1-Phosphate and Promotes Cell Growth and Survival

Ana Olivera et al.Nov 1, 1999
Sphingosine-1-phosphate (SPP) is a bioactive lipid that has recently been identified as the ligand for the EDG family of G protein-coupled cell surface receptors. However, the mitogenic and survival effects of exogenous SPP may not correlate with binding to cell-surface receptors (Van Brocklyn, J.R., M.J. Lee, R. Menzeleev, A. Olivera, L. Edsall, O. Cuvillier, D.M. Thomas, P.J.P. Coopman, S. Thangada, T. Hla, and S. Spiegel. 1998. J. Cell Biol. 142:229-240). The recent cloning of sphingosine kinase, a unique lipid kinase responsible for the formation of SPP, has provided a new tool to investigate the role of intracellular SPP. Expression of sphingosine kinase markedly increased SPP levels in NIH 3T3 fibroblasts and HEK293 cells, but no detectable secretion of SPP into the medium was observed. The increased sphingosine kinase activity in NIH 3T3 fibroblasts was sufficient to promote growth in low- serum media, expedite the G(1)/S transition, and increase DNA synthesis and the proportion of cells in the S phase of the cell cycle with a concomitant increase in cell numbers. Transient or stable overexpression of sphingosine kinase in NIH 3T3 fibroblasts or HEK293 cells protected against apoptosis induced by serum deprivation or ceramide elevation. N,N-Dimethylsphingosine, a competitive inhibitor of sphingosine kinase, blocked the effects of sphingosine kinase overexpression on cell proliferation and suppression of apoptosis. In contrast, pertussis toxin did not abrogate these biological responses. In Jurkat T cells, overexpression of sphingosine kinase also suppressed serum deprivation- and ceramide-induced apoptosis and, to a lesser extent, Fas-induced apoptosis, which correlated with inhibition of DEVDase activity, as well as inhibition of the executionary caspase-3. Taken together with ample evidence showing that growth and survival factors activate sphingosine kinase, our results indicate that SPP functions as a second messenger important for growth and survival of cells. Hence, SPP belongs to a novel class of lipid mediators that can function inside and outside cells.