JW
James Wynne
Author with expertise in Viral Hemorrhagic Fevers and Zoonotic Infections
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
5
(80% Open Access)
Cited by:
1,502
h-index:
37
/
i10-index:
65
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

Dead reckoning of protist viability with propidium monoazide (PMA)-quantitative PCR; a case study using Neoparamoeba perurans

James Wynne et al.Sep 24, 2024
The ability to distinguish between viable and non-viable protozoan parasites is central to improved human and animal health management. While conceptually simple, methods to differentiate cell viability in situ remain challenging. Amoebic gill disease, caused by Neoparamoeba perurans is a parasitic disease impacting Atlantic salmon aquaculture globally. Although commercial freshwater treatments alleviate AGD, viable amoebae remain on gills or in used treatment water. Existing PCR-based assays are able to quantify N. perurans abundance but cannot discriminate amoeba viability. We investigated the use of propidium monoazide (PMA) application, prior to real-time PCR, to distinguish between alive and dead cells. We demonstrate that 200 μM PMA can significantly reduce amplification from non-viable (isopropanol treated) cultured amoebae across at least three logs of cell concentrations. Using a serial dilution of viable and non-viable cells, we show that non-PMA PCR amplifies both viable and non-viable amoebae, while PMA exposure suppresses (but does not completely inhibit) amplification from non-viable amoebae. The effect of freshwater treatment on N. perurans viability was assessed using the PMA-PCR. Following PMA exposure, amplification from freshwater treated amoebae was reduced by approximately 94-97 %. Taken together this study demonstrates that PMA combined with traditional real-time PCR can estimate amoeba viability.
0

18S rRNA Metagenomic Analysis of Nodular Gill Disease in Swiss Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss)

James Wynne et al.Dec 5, 2024
ABSTRACT Nodular gill disease (NGD) is a serious proliferative gill condition that affects farmed salmonids, particularly in Europe. While the cause of NGD remains unknown (and maybe multifactorial), various amoebae are often isolated from the gills of affected fish and can in some cases be seen associated with lesions by histopathology. The present study aimed to quantify the abundance of different amoeba species directly from the gills of rainbow trout affected by NGD and healthy controls. An 18S rRNA amplicon metagenomic approach was employed to profile the diversity and abundance of micro‐eukaryotes (including amoebae) while suppressing the amplification of host DNA using a salmonid‐specific C3 spacer blocking primer. The 18S rRNA metagenomics approach identified a diversity of micro‐eukaryotes on the gills of rainbow trout, including the phylum's Amoebozoa , Diatomea , Platyhelminthes and Ciliophora . Rainbow trout clinically affected by NGD had a significantly higher abundance of a specific sequence (zOTU2) classified as Vannella sp. compared to healthy controls. A quantitative PCR assay was then developed and validated which accurately quantified the abundance of this Vannella sp. sequence from a NGD outbreak in a Swiss rainbow trout farm. Additional PCR and Sanger sequencing analysis of the zOTU2 sequence demonstrated that this sequence is most likely derived from Vannella mustalahtiana . Our study highlights the potential role of Vannella mustalahtiana in NGD in Switzerland and further describes a specific and validated diagnostic PCR assay for accurate detection of this Vannella species.