To study the biodistribution of MSCs, we labeled adult murine C57BL/6 MSCs with firefly luciferase and DsRed2 fluorescent protein using nonviral Sleeping Beauty transposons and coinfused labeled MSCs with bone marrow into irradiated allogeneic recipients. Using in vivo whole-body imaging, luciferase signals were shown to be increased between weeks 3 and 12. Unexpectedly, some mice with the highest luciferase signals died and all surviving mice developed foci of sarcoma in their lungs. Two mice also developed sarcomas in their extremities. Common cytogenetic abnormalities were identified in tumor cells isolated from different animals. Original MSC cultures not labeled with transposons, as well as independently isolated cultured MSCs, were found to be cytogenetically abnormal. Moreover, primary MSCs derived from the bone marrow of both BALB/c and C57BL/6 mice showed cytogenetic aberrations after several passages in vitro, showing that transformation was not a strain-specific nor rare event. Clonal evolution was observed in vivo, suggesting that the critical transformation event(s) occurred before infusion. Mapping of the transposition insertion sites did not identify an obvious transposon-related genetic abnormality, and p53 was not overexpressed. Infusion of MSC-derived sarcoma cells resulted in malignant lesions in secondary recipients. This new sarcoma cell line, S1, is unique in having a cytogenetic profile similar to human sarcoma and contains bioluminescent and fluorescent genes, making it useful for investigations of cellular biodistribution and tumor response to therapy in vivo. More importantly, our study indicates that sarcoma can evolve from MSC cultures.

Recessive dystrophic epidermolysis bullosa is an incurable, often fatal mucocutaneous blistering disease caused by mutations in COL7A1, the gene encoding type VII collagen (C7). On the basis of preclinical data showing biochemical correction and prolonged survival in col7 −/− mice, we hypothesized that allogeneic marrow contains stem cells capable of ameliorating the manifestations of recessive dystrophic epidermolysis bullosa in humans.Between October 2007 and August 2009, we treated seven children who had recessive dystrophic epidermolysis bullosa with immunomyeloablative chemotherapy and allogeneic stem-cell transplantation. We assessed C7 expression by means of immunofluorescence staining and used transmission electron microscopy to visualize anchoring fibrils. We measured chimerism by means of competitive polymerase-chain-reaction assay, and documented blister formation and wound healing with the use of digital photography.One patient died of cardiomyopathy before transplantation. Of the remaining six patients, one had severe regimen-related cutaneous toxicity, with all having improved wound healing and a reduction in blister formation between 30 and 130 days after transplantation. We observed increased C7 deposition at the dermal-epidermal junction in five of the six recipients, albeit without normalization of anchoring fibrils. Five recipients were alive 130 to 799 days after transplantation; one died at 183 days as a consequence of graft rejection and infection. The six recipients had substantial proportions of donor cells in the skin, and none had detectable anti-C7 antibodies.Increased C7 deposition and a sustained presence of donor cells were found in the skin of children with recessive dystrophic epidermolysis bullosa after allogeneic bone marrow transplantation. Further studies are needed to assess the long-term risks and benefits of such therapy in patients with this disorder. (Funded by the National Institutes of Health; ClinicalTrials.gov number, NCT00478244.)

Recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) is characterized by a functional deficit of type VII collagen protein due to gene defects in the type VII collagen gene (COL7A1). Gene augmentation therapies are promising, but run the risk of insertional mutagenesis. To abrogate this risk, we explored the possibility of using engineered transcription activator-like effector nucleases (TALEN) for precise genome editing. We report the ability of TALEN to induce site-specific double-stranded DNA breaks (DSBs) leading to homology-directed repair (HDR) from an exogenous donor template. This process resulted in COL7A1 gene mutation correction in primary fibroblasts that were subsequently reprogrammed into inducible pluripotent stem cells and showed normal protein expression and deposition in a teratoma-based skin model in vivo. Deep sequencing-based genome-wide screening established a safety profile showing on-target activity and three off-target (OT) loci that, importantly, were at least 10 kb from a coding sequence. This study provides proof-of-concept for TALEN-mediated in situ correction of an endogenous patient-specific gene mutation and used an unbiased screen for comprehensive TALEN target mapping that will cooperatively facilitate translational application.