Cold stress is a major environmental factor that limits plant growth and development. The C-repeat-binding factor (CBF)-dependent cold signaling pathway is extensively studied in Arabidopsis; however, the specific protein kinases involved in this pathway remain elusive. Here we report that OST1 (OPEN STOMATA 1), a well-known Ser/Thr protein kinase in ABA signaling, acts upstream of CBFs to positively regulate freezing tolerance. The ost1 mutants show freezing hypersensitivity, whereas transgenic plants overexpressing OST1 exhibit enhanced freezing tolerance. The OST1 kinase is activated by cold stress. Moreover, OST1 interacts with both the transcription factor ICE1 and the E3 ligase HOS1 in the CBF pathway. Cold-activated OST1 phosphorylates ICE1 and enhances its stability and transcriptional activity. Meanwhile, OST1 interferes with the interaction between HOS1 and ICE1, thus suppressing HOS1-mediated ICE1 degradation under cold stress. Our results thus uncover the unexpected roles of OST1 in modulating CBF-dependent cold signaling in Arabidopsis.

Summary In Arabidopsis, the C‐repeat binding factors ( CBF s) have been extensively studied as key transcription factors in the cold stress response. However, their exact functions in the cold response remains unclear due to the lack of a null cbf triple mutant. In this study, we used CRISPR /Cas9 technology to mutate CBF 1 or CBF 1/ CBF 2 in a cbf3 T‐ DNA insertion mutant to generate cbf1,3 double and cbf1 cbf2 cbf3 ( cbfs ) triple mutants. The response of the cbfs triple mutants to chilling stress is impaired. Furthermore, no significant difference in freezing tolerance was observed between the wild‐type and the cbf1,3 and cbfs mutants without cold acclimation. However, the cbfs mutants were extremely sensitive to freezing stress after cold acclimation, and freezing sensitivity ranking was cbfs > cbf1,3 > cbf3 . RNA ‐Seq analysis showed that 134 genes were CBF regulated, of which 112 were regulated positively and 22 negatively by CBF s. Our study reveals the essential functions of CBF s in chilling stress response and cold acclimation, as well as defines a set of genes as CBF regulon. It also provides materials for the genetic dissection of components in CBF ‐dependent cold signaling.

Low temperatures affect plant growth, development, productivity, and ecological distribution. Expression of the C-repeat-binding factor (CBF) transcription factors is induced by cold stress, which in turn activates downstream cold-responsive (COR) genes that are required for the acquisition of freezing tolerance. Inducer of CBF expression 1 (ICE1) is a master regulator of CBFs, and ICE1 stability is crucial for its function. However, the regulation of ICE1 is not well understood. Here, we report that mitogen-activated protein kinase 3 (MPK3) and MPK6 interact with and phosphorylate ICE1, which reduces its stability and transcriptional activity. Consistently, the mpk3 and mpk6 single mutants and the mpk3 mpk6 double mutants show enhanced freezing tolerance, whereas MPK3/MPK6 activation attenuates freezing tolerance. Phosphor-inactive mutations of ICE1 complement freezing sensitivity in the ice1-2 mutant. These combined results indicate that MPK3/MPK6 phosphorylate and destabilize ICE1, which negatively regulates CBF expression and freezing tolerance in plants.

Abstract Clade A protein phosphatase 2Cs (PP2Cs) are abscisic acid (ABA) co-receptors that block ABA signalling by inhibiting the downstream protein kinases. ABA signalling is activated after PP2Cs are inhibited by ABA-bound PYR/PYL/RCAR ABA receptors (PYLs) in Arabidopsis . However, whether these PP2Cs are regulated by other factors remains unknown. Here, we report that ABI1 (ABA-INSENSITIVE 1) can interact with the U-box E3 ligases PUB12 and PUB13, but is ubiquitinated only when it interacts with ABA receptors in an in vitro assay. A mutant form of ABI1-1 that is unable to interact with PYLs is more stable than the wild-type protein. Both ABI1 degradation and all tested ABA responses are reduced in pub12 pub13 mutants compared with the wild type. Introducing the abi1-3 loss-of-function mutation into pub12 pub13 mutant recovers the ABA-insensitive phenotypes of the pub12 pub13 mutant. We thus uncover an important regulatory mechanism for regulating ABI1 levels by PUB12 and PUB13.

Abstract Low temperature is a major factor limiting rice productivity and geographical distribution. Improved cold tolerance and expanded cultivation to high-altitude or high-latitude regions would help meet growing rice demand. Here we explored a QTL for cold tolerance and cloned the gene, CTB4a (cold tolerance at booting stage), encoding a conserved leucine-rich repeat receptor-like kinase. We show that different CTB4a alleles confer distinct levels of cold tolerance and selection for variation in the CTB4a promoter region has occurred on the basis of environmental temperature. The newly generated cold-tolerant haplotype Tej -Hap-KMXBG was retained by artificial selection during temperate japonica evolution in cold habitats for low-temperature acclimation. Moreover, CTB4a interacts with AtpB, a beta subunit of ATP synthase. Upregulation of CTB4a correlates with increased ATP synthase activity, ATP content, enhanced seed setting and improved yield under cold stress conditions. These findings suggest strategies to improve cold tolerance in crop plants.

Cold acclimation is a crucial strategy for plant survival at freezing temperatures. C-REPEAT BINDING FACTOR (CBF) genes are rapidly and transiently induced by low temperature and play important roles in cold acclimation. However, the mechanism underlying the attenuation of CBF expression during the later stages of the cold stress response is obscure. Here, we show that the protein kinase BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2 (BIN2) interacts with and phosphorylates INDUCER OF CBF EXPRESSION1 (ICE1) in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) under prolonged cold stress, facilitating the interaction between ICE1 and the E3 ubiquitin ligase HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENE1 and thereby promoting ICE1 degradation. The kinase activity of BIN2 is inhibited during the early stages of the cold stress response and is subsequently restored, suggesting that BIN2 mainly downregulates ICE1 abundance when CBF expression is attenuated. A loss-of-function mutation of ICE1 partially suppresses the cold-induced expression of CBFs and compromises the enhanced freezing tolerance of bin2-3 bil1 bil2. These findings reveal an important role for BIN2 in fine-tuning CBF expression, and thus in balancing plant growth and the cold stress response.