Mycoviruses are viruses that infect fungi and have the potential to control fungal diseases of crops when associated with hypovirulence. Typically, mycoviruses have double-stranded (ds) or single-stranded (ss) RNA genomes. No mycoviruses with DNA genomes have previously been reported. Here, we describe a hypovirulence-associated circular ssDNA mycovirus from the plant pathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum . The genome of this ssDNA virus, named Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence-associated DNA virus 1 (SsHADV-1), is 2166 nt, coding for a replication initiation protein (Rep) and a coat protein (CP). Although phylogenetic analysis of Rep showed that SsHADV-1 is related to geminiviruses, it is notably distinct from geminiviruses both in genome organization and particle morphology. Polyethylene glycol-mediated transfection of fungal protoplasts was successful with either purified SsHADV-1 particles or viral DNA isolated directly from infected mycelium. The discovery of an ssDNA mycovirus enhances the potential of exploring fungal viruses as valuable tools for molecular manipulation of fungi and for plant disease control and expands our knowledge of global virus ecology and evolution.

Mycoviruses are thought not to be infectious as free particles and to lack an extracellular phase in their life cycles, limiting the broad use of hypovirulence-associated mycoviruses in controlling fungal disease. Here, we demonstrate that purified particles of a DNA mycovirus, Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence-associated DNA virus 1 (SsHADV-1), are infectious when applied extracellularly to its host Sclerotinia sclerotiorum . Virus particles isolated from an infected host can infect the hyphae of virus-free S. sclerotiorum directly when applied to hyphae grown on potato dextrose agar or sprayed on leaves of Arabidopsis thaliana and Brassica napus , regardless of vegetative compatibility affiliation. When applied to leaves, the virus can suppress the development of lesions. SsHADV-1 can also reduce disease severity and enhance rapeseed yield significantly under field conditions. SsHADV-1 has a narrow host range; it can infect Sclerotinia minor and Sclerotinia nivalis , sister species of S. sclerotiorum , and cause debilitation of these two fungi, but cannot infect or transfect other tested fungi, such as Botrytis cinerea , which shares the same family with S. sclerotiorum . Virus particles are likely to be very stable on the leaves of A. thaliana plants because viral DNA could be detected at 15 d postinoculation on unwounded leaves and at 10 d postinoculation on wounded leaves, respectively; however, this virus could not infect and move in plant cells. Our findings may prompt a reconsideration of the generalization that mycoviruses lack an extracellular phase in their life cycles and stimulate the search for other DNA mycoviruses with potential use as natural fungicides.

Mycoviruses are widespread in nature and often occur with dsRNA and positive-stranded RNA genomes. Recently, strong evidence from RNA sequencing analysis suggested that negative-stranded (-)ssRNA viruses could infect fungi. Here we describe a (-)ssRNA virus, Sclerotinia sclerotiorum negative-stranded RNA virus 1 (SsNSRV-1), isolated from a hypovirulent strain of Sclerotinia sclerotiorum. The complete genome of SsNSRV-1 is 10,002 nt with six ORFs that are nonoverlapping and linearly arranged. Conserved gene-junction sequences that occur widely in mononegaviruses, (A/U)(U/A/C)UAUU(U/A)AA(U/G)AAAACUUAGG(A/U)(G/U), were identified between these ORFs. The analyses 5' and 3' rapid amplification of cDNA ends showed that all genes can be transcribed independently. ORF V encodes the largest protein that contains a conserved mononegaviral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) domain. Putative enveloped virion-like structures with filamentous morphology similar to members of Filoviridae were observed both in virion preparation samples and in ultrathin hyphal sections. The nucleocapsids are long, flexible, and helical; and are 22 nm in diameter and 200-2,000 nm in length. SDS/PAGE showed that the nucleocapsid possibly contains two nucleoproteins with different molecular masses, ∼43 kDa (p43) and ∼41 kDa (p41), and both are translated from ORF II. Purified SsNSRV-1 virions successfully transfected a virus-free strain of S. sclerotiorum and conferred hypovirulence. Phylogenetic analysis based on RdRp showed that SsNSRV-1 is clustered with viruses of Nyamiviridae and Bornaviridae. Moreover, SsNSRV-1 is widely distributed, as it has been detected in different regions of China. Our findings demonstrate that a (-)ssRNA virus can occur naturally in fungi and enhance our understanding of the ecology and evolution of (-)ssRNA viruses.