Dorit B. Donoviel, Anna-Katerina Hadjantonakis, Masaki Ikeda, Hui Zheng, Peter St George Hyslop, and Alan Bernstein Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto, Ontario, Canada M5G-1X5; Centre for Research in Neurodegenerative Diseases and Department of Medicine, Division of Neurology, University of Toronto. The Toronto Hospital, Toronto, Ontario, Canada M5S-3H2; Merck Research Laboratories, Rahway, New Jersey 07065 USA; Department of Medical Genetics and Microbiology, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada M5S-1A8

Abstract

 Background: Vav is a guanine-nucleotide exchange factor for the Rho-like small GTPases RhoA, Rac1 and Cdc42, which regulate cytoskeletal reorganization and activation of stress-activated protein kinases (SAPK/JNKs). Vav is expressed in hematopoietic cells and is phosphorylated in T and B cells following activation of various growth factor or antigen receptors. Vav interacts with several signaling molecules in T cells, but the functional relevance of these interactions is established only for Slp 76: they cooperate to induce activity of the transcription factor NF-AT and interleukin-2 expression. We have investigated the role of Vav in T cells by generating vav^−/− mice. Results: Mice deficient for vav were viable and healthy, but had impaired T-cell development. In vav^−/− T cells, in response to activation of the T-cell receptor (TCR), cell cycle progression, induction of NF-ATc1 activity, downregulation of the cell-cycle inhibitor p27^Kip1, interleukin-2 production, actin polymerization and the clustering of TCRs into patches and caps – a cytoskeletal reorganization process – were defective. TCR-mediated activation of mitogen-activated protein kinase and SAPK/JNK was unaffected. Ca²⁺ mobilization was impaired in vav^−/− thymocytes and T cells. In wild-type cells, Vav constitutively associated with the cytoskeletal membrane anchors talin and vinculin. In the absence of Vav, phosphorylation of Slp76, Slp76–talin interactions, and recruitment of the actin cytoskeleton to the CD3ζ chain of the TCR co-receptor were impaired. Conclusions: Vav is a crucial regulator of TCR-mediated Ca²⁺ flux, cytoskeletal reorganization and TCR clustering, and these are required for T-cell maturation, interleukin-2 production and cell cycle progression.

We have investigated the role of the p53 gene in oncogenesis in vivo by generating transgenic mice carrying murine p53 genomic fragments isolated from a mouse Friend erythroleukemia cell line or BALB/c mouse liver DNA. Elevated levels of p53 mRNA were detected in several tissues of two transgenic lines tested. Increased levels of p53 protein were also detected in most of the tissues analyzed by Western blotting (immunoblotting). Because both transgenes encoded p53 proteins that were antigenically distinct from wild-type p53, it was possible to demonstrate that overexpression of the p53 protein was mostly, if not entirely, due to the expression of the transgenes. Neoplasms developed in 20% of the transgenic mice, with a high incidence of lung adenocarcinomas, osteosarcomas, and lymphomas. Tissues such as ovaries that expressed the transgene at high levels were not at higher risk of malignant transformation than tissues expressing p53 protein at much lower levels. The long latent period and low penetrance suggest that overexpression of p53 alone is not sufficient to induce malignancies and that additional events are required. These observations provide direct evidence that mutant alleles of the p53 oncogene have oncogenic potential in vivo and that different cell types show intrinsic differences in susceptibility to malignant transformation by p53. Since recent data suggest that p53 may be a recessive oncogene, it is possible that the elevated tumor incidence results from functional inactivation of endogenous p53 by overexpression of the mutant transgene. The high incidence of lung and bone tumors suggests that p53 transgenic mice may provide a useful model to investigate the molecular events that underlie these malignancies in humans.

Mutations at the mouse W/c-kit locus lead to intrinsic defects in stem cells of the melanocytic, hematopoietic, and germ cell lineages. W alleles vary in the overall severity of phenotype that they confer, and some alleles exhibit an independence of pleiotropic effects. To elucidate the molecular basis for these biological differences, we analyzed the c-kit locus and the c-kit-associated autophosphorylation activities in five different W mutants representative of a range of W phenotypes. Mast cell cultures derived from mice or embryos homozygous for each W allele were deficient in c-kit autophosphorylation activity, the extent of which paralleled the severity of phenotype conferred by a given W allele both in vivo and in an in vitro mast cell coculture assay. The mildly dominant, homozygous viable alleles W44 and W57 were found to express reduced levels of an apparently normal c-kit protein. In contrast, c-kit kinase defects conferred by the moderately dominant, homozygous viable alleles W41 or W55 or the homozygous lethal allele, W37, were attributed to single-point mutations within the kinase domain of the c-kit polypeptide, which result in point substitutions of amino acid residues highly conserved in the family of protein tyrosine kinases. The nature and location of these amino acid substitutions account for the relative severity of phenotypes conferred by these W alleles and demonstrate that the pleiotropic developmental defects associated with the W/c-kit locus arise as the result of dominant loss-of-function mutations in a transmembrane receptor tyrosine kinase.