Abstract Purpose: The effectiveness of NK cell infusions to induce leukemic remission is limited by lack of both antigen specificity and in vivo expansion. To address the first issue, we previously generated a bispecific killer engager (BiKE) containing single-chain scFv against CD16 and CD33 to create an immunologic synapse between NK cells and CD33+ myeloid targets. We have now incorporated a novel modified human IL15 crosslinker, producing a 161533 trispecific killer engager (TriKE) to induce expansion, priming, and survival, which we hypothesize will enhance clinical efficacy. Experimental Design: Reagents were tested in proliferation and functional assays and in an in vivo xenograft model of AML. Results: When compared with the 1633 BiKE, the 161533 TriKE induced superior NK cell cytotoxicity, degranulation, and cytokine production against CD33+ HL-60 targets and increased NK survival and proliferation. Specificity was shown by the ability of a 1615EpCAM TriKE to kill CD33-EpCAM+ targets. Using NK cells from patients after allogeneic stem cell transplantation when NK cell function is defective, the 161533 TriKE restored potent NK function against primary AML targets and induced specific NK cell proliferation. These results were confirmed in an immunodeficient mouse HL-60-Luc tumor model where the 161533 TriKE exhibited superior antitumor activity and induced in vivo persistence and survival of human NK cells for at least 3 weeks. Conclusions: Off-the-shelf 161533 TriKE imparts antigen specificity and promotes in vivo persistence, activation, and survival of NK cells. These qualities are ideal for NK cell therapy of myeloid malignancies or targeting antigens of solid tumors. Clin Cancer Res; 22(14); 3440–50. ©2016 AACR. See related commentary by Talmadge, p. 3419

NK cell-based immunotherapies have been gaining traction in the clinic for treatment of cancer. IL-15 is currently being used in number of clinical trials to improve NK cell expansion and function. The objective of this study is to evaluate the effect of repetitive IL-15 exposure on NK cells. An in vitro model in which human NK cells are continuously (on on on) or intermittently (on off on) treated with IL-15 was used to explore this question. After treatment, cells were evaluated for proliferation, survival, cell cycle gene expression, function, and metabolic processes. Our data indicate that continuous treatment of NK cells with IL-15 resulted in decreased viability and a cell cycle arrest gene expression pattern. This was associated with diminished signaling, decreased function both in vitro and in vivo, and reduced tumor control. NK cells continuously treated with IL-15 also displayed a reduced mitochondrial respiration profile when compared with NK cells treated intermittently with IL-15. This profile was characterized by a decrease in the spare respiratory capacity that was dependent on fatty acid oxidation (FAO). Limiting the strength of IL-15 signaling via utilization of an mTOR inhibitor rescued NK cell functionality in the group continuously treated with IL-15. The findings presented here show that human NK cells continuously treated with IL-15 undergo a process consistent with exhaustion that is accompanied by a reduction in FAO. These findings should inform IL-15-dosing strategies in NK cell cancer immunotherapeutic settings.