Abstract The cornerstone of treatment for advanced ALK-positive lung cancer is sequential therapy with increasingly potent and selective ALK inhibitors. The third-generation ALK inhibitor lorlatinib has demonstrated clinical activity in patients who failed previous ALK inhibitors. To define the spectrum of ALK mutations that confer lorlatinib resistance, we performed accelerated mutagenesis screening of Ba/F3 cells expressing EML4–ALK. Under comparable conditions, N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) mutagenesis generated numerous crizotinib-resistant but no lorlatinib-resistant clones harboring single ALK mutations. In similar screens with EML4–ALK containing single ALK resistance mutations, numerous lorlatinib-resistant clones emerged harboring compound ALK mutations. To determine the clinical relevance of these mutations, we analyzed repeat biopsies from lorlatinib-resistant patients. Seven of 20 samples (35%) harbored compound ALK mutations, including two identified in the ENU screen. Whole-exome sequencing in three cases confirmed the stepwise accumulation of ALK mutations during sequential treatment. These results suggest that sequential ALK inhibitors can foster the emergence of compound ALK mutations, identification of which is critical to informing drug design and developing effective therapeutic strategies. Significance: Treatment with sequential first-, second-, and third-generation ALK inhibitors can select for compound ALK mutations that confer high-level resistance to ALK-targeted therapies. A more efficacious long-term strategy may be up-front treatment with a third-generation ALK inhibitor to prevent the emergence of on-target resistance. Cancer Discov; 8(6); 714–29. ©2018 AACR. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 663

Purpose The ROS1 tyrosine kinase is activated through ROS1 gene rearrangements in 1% to 2% of non–small-cell lung cancers (NSCLCs), which confer sensitivity to treatment with the anaplastic lymphoma kinase (ALK)/ROS1/mesenchymal-epithelial transition factor inhibitor crizotinib. Currently, insights into patterns of metastatic spread and mechanisms of crizotinib resistance among patients with ROS1-positive disease are limited. Patients and Methods We reviewed clinical and radiographic imaging data of patients with ROS1- and ALK-positive NSCLC to compare patterns of metastatic spread at initial metastatic diagnosis. To determine molecular mechanisms of crizotinib resistance, we analyzed repeat biopsy specimens from a cohort of patients with ROS1-positive disease who progressed on crizotinib. Results We identified 39 and 196 patients with advanced ROS1- and ALK-positive NSCLC, respectively. Patients with ROS1-positive disease had significantly lower rates of extrathoracic metastases ( ROS1, 59.0%; ALK, 83.2%; P = .002), including lower rates of brain metastases ( ROS1, 19.4%; ALK, 39.1%; P = .033), at initial metastatic diagnosis. Despite similar overall survival between patients with ALK- and ROS1-positive NSCLC treated with crizotinib (median, 3.0 v 2.5 years, respectively; P = .786), patients with ROS1-positive NSCLC also had a significantly lower cumulative incidence of brain metastases (34% v 73% at 5 years; P < .001). In addition, we identified 16 patients who underwent a total of 17 repeat biopsies after progression on crizotinib. ROS1 resistance mutations were identified in 53% of specimens, including nine (64%) of 14 non–brain metastasis specimens. ROS1 mutations included G2032R (41%), D2033N (6%), and S1986F (6%). Conclusion Compared with ALK rearrangements, ROS1 rearrangements are associated with lower rates of extrathoracic metastases, including fewer brain metastases, at initial metastatic diagnosis. ROS1 resistance mutations, particularly G2032R, appear to be the predominant mechanism of resistance to crizotinib, which underscores the need to develop novel ROS1 inhibitors with activity against these resistant mutants.