Diabetes mellitus is characterized by increased levels of reactive oxygen species (ROS), leading to high levels of adenosine triphosphate (ATP) and the activation of purinergic receptors (P2X7), which results in cell death. Klotho was recently described as a modulator of oxidative stress and as having anti-apoptotic properties, among others. However, the roles of P2X7 and klotho in the progression of diabetic nephropathy are still unclear. In this context, the aim of the present study was to characterize P2X7 and klotho in several stages of diabetes in rats. Diabetes was induced in Wistar rats by streptozotocin, while the control group rats received the drug vehicle. From the 1st to 8th weeks after the diabetes induction, the animals were placed in metabolic cages on the 1st day of each week for 24 h to analyze metabolic parameters and for the urine collection. Then, blood samples and the kidneys were collected for biochemical analysis, including Western blotting and qPCR for P2X7 and klotho. Diabetic rats presented a progressive loss of renal function, with reduced nitric oxide and increased lipid peroxidation. The P2X7 and klotho expressions were similar up to the 4th week; then, P2X7 expression increased in diabetes mellitus (DM), but klotho expression presented an opposite behavior, until the 8th week. Our data show an inverse correlation between P2X7 and klotho expressions through the development of DM, which suggests that the management of these molecules could be useful for controlling the progression of this disease and diabetic nephropathy.

To evaluate the effects of esculin treatment on P2X7 receptor and mitochondrial dysfunction in the renal cortex of diabetic rats.Male Wistar rats, 7 weeks old, were unilaterally nephrectomized. Part of these animals were induced to diabetes using streptozotocin (60 mg/kg). Diabetes was confirmed 48 h after induction, with blood glucose levels ≥200 mg/dL. Part of control and diabetic animals were selected to receive daily doses of esculin (50 mg/kg), during 8 weeks. The animals were placed in metabolic cages at the eighth week of protocol for 24 h urine collection and a small aliquot of blood was collected for biochemical analysis. After this procedure, the animals were euthanized and the remaining kidney was stored for histopathological analysis, Western blotting and mitochondrial high-resolution respirometry.Although esculin did not change metabolic parameters, renal biochemical function, neither TBARS in DM rats, esculin reduced P2X7 levels in these animals and restored mitochondrial function via glycolysis substrates and β-oxidation. Besides, at the histological analysis, we observed that esculin reduced inflammatory infiltrates and collagen IV deposits as compared to diabetic group.Esculin attenuated the development of renal injuries caused by hyperglycemia, proinflammatory and oxidative mechanisms mediated by P2X7 receptor, as seen by histological findings and improved mitochondrial function in diabetic animals. This suggests that esculin could be used as an adjuvant therapy to prevent the diabetic nephropathy.

To evaluate the effects of P2X7 receptor blockade on renin-angiotensin system (RAS) in rats with diabetic nephropathy (DN).Wistar rats were unilaterally nephrectomized and received streptozotocin for diabetes mellitus (DM) induction; control animals (CTL) received the drug vehicle. The animals were submitted to P2X7 receptor silencing, forming the group (DM + siRNA). The animals were placed in metabolic cages for data collection and evaluation of renal function; at the end of the protocol, the kidney was removed for analysis of P2X7, renin, angiotensin-converting enzyme (ACE), ACE2, angiotensin, thiobarbituric acid reactive substance levels (TBARS), nitric oxide (NO) and qualitative histological.The metabolic profile was attenuated in DM + siRNA vs. DM and there was a significant improvement in creatinine, urea and proteinuria levels in the same group. Renin expression was significantly decreased in DM + siRNA vs. DM. ACE and ACE2 were significantly reduced in DM + siRNA vs. DM. TBARS levels were decreased and NO showed an increase in DM + siRNA vs. DM, both significant. All histological alterations were improved in DM + siRNA vs. DM.Data have shown that although silencing of the P2X7 receptor did not decrease fasting glucose, it promoted an improvement in the metabolic profile and a significant recovery of renal function, revealing a protective action by the inhibition of this receptor. This effect must have occurred due to the inhibition of RAS and the increase of NO, suggesting that the use of P2X7 receptors inhibitors could be used as adjuvant therapy against DN progression.

Previous studies in our laboratory have suggested that P2X7 could contribute to the progression of diabetic nephropathy and modulated klotho expression. The aim of this study was to investigate if P2X7 receptor is related to the expression of klotho in the onset of diabetic nephropathy in rats. Seven-week-old male Wistar rats weighing 210 g were all uninephrectomized; two-third of the animals were induced to diabetes with 60 mg/kg streptozotocin i.v., and one-third received its vehicle (control rats). At 4th day of the fifth week of the protocol, half of the diabetic rats received a small interfering RNA targeting for P2X7 mRNA, and the other half received its vehicle. Euthanasia was made at the eighth week. Diabetic animals reproduced all classic symptoms of the disease; besides, they showed reduced renal function and low NO bioavailability; also, SOD1, SOD2, and catalase were increased, probably due to the oxidative stress which was elevated in this situation. Metabolic data of diabetic rats did not change by silencing P2X7 receptor. For the other hand, silencing P2X7 was able to contribute to balance oxidative and nitrosative profile, ultimately improving the renal function and increasing plasma and membrane forms of klotho. These findings suggest that the management of P2X7 receptor can benefit the kidneys with diabetic nephropathy. Further studies are needed to show the therapeutic potential of this receptor inhibition to provide a better quality of life for the diabetic patient.

Diabetes mellitus is a chronic disease, which progresses with many complications such as the diabetic nephropathy (DN). P2X7 receptor is expressed in pathological conditions, in response to high concentrations of extracellular ATP, as seen in hyperglycemia. When constantly activated, P2X7 can induce inflammatory responses, leading to oxidative stress (OS) and triggering toxic biochemical processes. Coumarin derivatives, such as esculin, are mainly antioxidants but their pharmacodynamics are not yet fully understood. The aim of this study is to evaluate the effects of esculin on P2X7 expression in the kidneys of diabetic rats. In male Wistar rats 7 weeks old, diabetes was induced by a single dose of streptozotocin (60 mg/kg; i.v.); CTL group received only the vehicle. Diabetes was considered in animals with fasting glycaemia greater than 200 mg/dL, 48 hours after induction. Then, the animals received daily doses of esculin (50 mg/kg, p.o.) forming CTL+ESC and DM+ESC groups. 24-hours urine and a small aliquot of blood via retro-orbital plexus were collected for biochemical analysis. The animals were euthanized under anesthesia, at the end of the eighth week of protocol and the kidneys were collected for Western blotting analysis, using antibodies against P2X7. The results are described as mean ± SEM; significance for p<0.05. The protein content of P2X7 was significantly decreased in the renal cortex of diabetic animals that received esculin when compared to untreated diabetic animals (0.76±0.11 vs 1.33±0.21). These animals also presented lower proteinuria (38.72±4.82 vs 45.42±3.0) and urinary TBARS excretion (232.3±28.83 vs 282.0±7.2), both p<0.05 compared with untreated diabetic animals. Our data suggest that esculin treatment decreases the P2X7 receptor in diabetic animals, accompanied by reduced OS and proteinuria, an early marker of DN, pointing to a new treatment that can be applied to control the evolution of this disease.

Diabetes mellitus is the largest epidemic disease of the 21st century and the International Diabetes Federation estimated that around 415 million people were diagnosed as diabetic by the year 2015; the projections for 2035 estimate that there will be 592 million in the World. Hyperglycemia, characteristic of this disease activates several pathways that in association with mitochondrial dysfunction culminate in the exacerbated production of reactive oxygen species. A previous study in our laboratory showed that oxidative stress was associated with an increases synthesis and activation of the P2X7 receptor (P2X7R), at the 8th week of diabetes, but the exact moment when its production become significant remains unknown. Purpose of this study is to evaluate the first moment in which P2X7R becomes highly expressed in the earliest phase of diabetes. Male Wistar rats at 7 weeks of age were all nephrectomized unilaterally. In half of the animals the diabetes was induced with streptozotocin (60mg/kg, i.v.) (DM), the others received its vehicle (CTL). After 24h of induction diabetes was confirmed as glycemia > 200mg/dL. The animals were euthanized on the first and subsequent weeks of diabetes up to eighth week and the kidney was collected and stored in a freezer at -80°C. The renal cortex was homogenized for Western blotting and quantified by polymerase chain reaction (qPCR). The results were analyzed with ANOVA of repeated measures with significance determined for p <0.05. RESULTS: Our qPCR data showed that only after the third week there was a decrease in P2X7 mRNA levels; however, in the sixth week of diabetes a significant increase in the mRNA synthesis was observed in DM group when compared to CTL; in the seventh and eighth weeks it presented a progressive decrease of these levels. The protein profile (Western blot) was similar to the qPCR data; in the first five weeks of DM, the P2X7 protein production was lower, but at the sixth week there was a significant increase in protein content for this receptor. Conclusion: Our preliminary data suggest that in the sixth week of diabetes the first and significant increase of the P2X7 gene expression and protein occurred. This is perhaps the main initial mark of the damage which can be caused by this receptor, as part of diabetes pathology.

Hyperglycemia present in diabetes mellitus is responsible for the increase of ATP, an agonist for P2X7 receptor. Activation of this receptor promotes the opening of channels and pores in the plasmatic membrane, leading to the release of cytokines and/or cell death and it is considered among the causes of DN. The aim of this study was to evaluate the P2X7 in the progression of DN and its correlation with inflammatory markers in rats kidneys. Male adult Wistar rats were alocated into 2 groups: DM received streptozotocin for diabetes induction; CTL received vehicle. At 5th, 6th, 7th and 8th weeks after diabetes induction, glycemia and body weight were evaluated, the animals were euthanized and the remaining kidney was collected for P2X7, IL-6 and IL-10 analysis by Western blotting and histology. Statistical analysis: we utilized unpaired Student's t test, and correlations were made by Spearman test, using GraphPad Prism 5.0. DM group glycemia was elevated in all weeks of diabetes and weight was reduced vs CTL. P2X7 was significantly increased in DM in all weeks analyzed. IL-6 increased progressively until the 8th week, vs CTL; IL-10 showed a gradual decrease with disease progression. Significant positive correlation was demonstrated between P2X7 and glycemia during the 7th and 8th weeks of diabetes; there was a moderate and positive correlation with P2X7 and IL-6. In the histology, the DM group presented inflammatory infiltrate, interstitial fibrosis and processes of tubular degeneration/regeneration from the 5th to 8th weeks after diabetes induction. Our findings show that P2X7 is increased in the evolution of diabetes and it is correlated with inflammation. Further studies are needed to assess whether inactivation of this receptor could be a therapeutic target in the management of diabetic nephropathy.

Previous studies in our laboratory have suggested that P2X7 could contribute to the progression of diabetic nephropathy and modulate klotho expression. Aim of this study was to investigate the role of P2X7 knockdown in the onset of diabetic nephropathy and its possible relationship with klotho, in rats. Seven-week-old male Wistar rats weighing 210g were all uninephrectomized; two-thirds were induced to diabetes with 60mg/kg streptozotocin i.v., and one-third received its vehicle (control rats). At 4th day of the fifth week of the protocol, half of the diabetic rats received a small interfering RNA targeting for P2X7 mRNA, and the other half received its vehicle. Euthanasia was made at the eighth week. Diabetic animals reproduced all classic symptoms of the disease; besides, they showed reduced renal function and low NO bioavailability; also, SOD1, SOD2 and catalase were increased, probably due to the oxidative stress factors which were elevated in this situation. Metabolic data of diabetic rats did not change by silencing P2X7 receptor. For the other hand, silencing P2X7 was able to increase plasma and membrane forms of klotho, which in turn could have contributed to balance oxidative and nitrosative profile, ultimately improving the renal function. These findings suggest that the management of P2X7 receptor can benefit the kidneys or perhaps even other organs involved in diabetic nephropathy. It can be used as an adjuvant therapy in this disease, improving the quality of life of diabetic patients.