Despite the growing interest in immunotherapeutic interventions for endometrial cancer (EC), the prevalence, phenotype, specificity and prognostic value of tumor infiltrating lymphocytes (TILs) in this tumor type remains unclear.To better understand the role of TILs in EC, we analyzed the phenotypic traits of CD8+ and CD4+ EC-resident T cells from 47 primary tumors by high-dimensional flow cytometry. In addition, CD8+ and CD4+ TIL subpopulations were isolated based on the differential expression of programmed cell death protein-1 (PD-1) (negative, dim and high) and CD39 (positive or negative) by fluorescence activated cell sorting (FACS), expanded in vitro, and screened for autologous tumor recognition. We further investigated whether phenotypic markers preferentially expressed on CD8+ and CD4+ tumor-reactive TIL subsets were associated with the four distinct molecular subtypes of EC, tumor mutational burden and patient survival.We found that CD8+TILs expressing high levels of PD-1 (PD-1hi) co-expressed CD39, TIM-3, HLA-DR and CXCL13, as compared with TILs lacking or displaying intermediate levels of PD-1 expression (PD-1- and PD-1dim, respectively). Autologous tumor reactivity of sorted and in vitro expanded CD8+ TILs demonstrated that the CD8+PD-1dimCD39+ and PD-1hiCD39+ T cell subsets both contained tumor-reactive TILs and that a higher level of PD-1 expression was associated with increased CD39 and a superior frequency of tumor reactivity. With respect to CD4+ T conventional (Tconv) TILs, co-expression of inhibitory and activation markers was more apparent on PD-1hi compared with PD-1- or PD-1dim T cells, and in fact, it was the CD4+PD-1hi subpopulation that accumulated the antitumor T cells irrespective of CD39 expression. Most importantly, detection of CD8+PD-1hiCD39+ and CD4+PD-1hi tumor-reactive T-cell subsets, but also markers specifically expressed by these subpopulations of TILs, that is, PD-1hi, CD39, CXCL13 and CD103 by CD8+ TILs and PD-1hi and CXCL13 by CD4+ Tconv TILs, correlated with prolonged survival of patients with EC.Our results demonstrate that EC are frequently infiltrated by tumor-reactive TILs, and that expression of PD-1hi and CD39 or PD-1hi can be used to select and expand CD8+ and CD4+ tumor-reactive TILs, respectively. In addition, biomarkers preferentially expressed on tumor-reactive TILs, rather than the frequency of CD3+, CD8+ and CD4+ lymphocytes, hold prognostic value suggesting their protective role in antitumor immunity.

Abstract Osteosarcoma (OS) remains a dismal malignancy in children and young adults, with poor outcome for metastatic and recurrent disease. Immunotherapies in OS are not as promising as in some other cancer types due to intra-tumor heterogeneity and considerable off-target expression of the potentially targetable proteins. Here we show that chimeric antigen receptor (CAR) T cells could successfully target an isoform of alkaline phosphatase, ALPL-1, which is highly and specifically expressed in primary and metastatic OS. The target recognition element of the second-generation CAR construct is based on two antibodies, previously shown to react against OS. T cells transduced with these CAR constructs mediate efficient and effective cytotoxicity against ALPL-positive cells in in vitro settings and in state-of-the-art in vivo orthotopic models of primary and metastatic OS, without unexpected toxicities against hematopoietic stem cells or healthy tissues. In summary, CAR-T cells targeting ALPL-1 show efficiency and specificity in treating OS in preclinical models, paving the path for clinical translation.

Humanized immunodeficient mice serve as critical models for investigating the functional interplay between transplanted human cells and a pre-reconstituted human immune system. These models facilitate the study of molecular and cellular pathogenic mechanisms and enable the evaluation of the efficacy and toxicity of immunotherapies, thereby accelerating their preclinical and clinical development. Current strategies rely on inefficient, long-term/delayed hematopoietic reconstitution by CD34+ hematopoietic progenitors or short-term reconstitution with peripheral blood mononuclear cells (PB-MNCs) associated with high rates of graft-versus-host disease (GvHD) and an inefficient representation of immune cell populations. Here, we hypothesized that immunologically naïve cord blood mononuclear cells (CB-MNCs) could serve as a superior alternative, providing long-lasting and functionally effective immune reconstitution. We conducted a comprehensive comparison between the non-obese diabetic (NOD).Cg-Prkdc∧ˆscid-IL2rg∧ˆtm1Wjl/SzJ (NSG) and NSG-Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)∧ˆ1Eav/MloySzJ (NSGS) immunodeficient mouse models following humanization with either PB-MNCs or CB-MNCs. We assessed the engraftment dynamics of various human immune cells over time and monitored the development of GvHD in both models. For the most promising model, we extensively evaluated immune cell functionality

Ewing Sarcoma (ES) is the second most common bone and soft tissue sarcoma affecting children and young adults. The dismal long-term survival in patients with metastatic/refractory disease is driven by the limited response rates to current multimodal therapies and the lack of actionable targets. This highlights the urgent need for developing new therapeutic approaches. Immunotherapy with chimeric antigen receptor (CAR)T-cells directed against a tumour-associated antigen (TAA) is a promising therapy with a safe and efficient profile in B-cell malignancies. However, the development of efficient and safe CAR T-cells for the treatment of ES is still challenging due to i) the low abundance of specific and safe TAAs, ii) and the presence of an immunosuppressive tumour microenvironment (iTME) that compromises CAR T-cells function. Here, we show preliminary data of specific ES-targets with limited expression in healthy tissues, the optimization of in vitro and in vivo cytotoxicity models which mimic the ES-iTME, and the initial assessment of a CAR T cell construct that turns the iTME to an immunologically hot tumour by triggering endogenous T-cell responses that enable epitope spreading.

One-year relapse rates of leukemia patients treated with CD19-targeted CAR-T cells (CAR19T) are >60% partly due to CAR19T intrinsic mechanisms and their interaction with leukemic cells and their microenvironment. Here, we have comprehensively characterized the expression of inhibitory immune checkpoint receptors (ICRs) in T-cells, and their ligands in both leukemic cells and mesenchymal stromal cells (MSC) from bone marrow (BM) of pediatric and adult primary B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients at diagnosis and relapse. Among all the ICRs-ligands analyzed, our results reveal a significant upregulation of the ICR TIM3 and its ligand Galectin-9 in T-cells and B-ALL/MSCs, respectively, during disease progression. The expression of TIM3 and Galectin-9 was significantly upregulated by CAR19Ts and CAR19T-resistant B-ALL cells, respectively, after in vitro cytotoxicity assays. Further in vivo assays using a TIM3 molecular decoy engineered to be secreted by T cells underpinned an inhibitory role for TIM3:Galectin-9 axis in CAR19T cell function and expansion. Targeting TIM3:Galectin-9 axis may represent a promising co-adjuvant therapy in B-ALL patients treated with CAR19Ts.

Ewing Sarcoma (ES) is the second most common bone and soft tissue sarcoma affecting children, adolescents, and young adults. Despite very intensive multimodal therapies, the current overall survival remains dismal, particularly in patients with metastatic or refractory disease. This highlights the urgent need for innovative therapeutic approaches. Adoptive immunotherapy with chimeric antigen receptor (CAR)-T cells directed against a tumour-associated antigen (TAA) is a promising therapy with a safe and efficient profile in B-cell malignancies. However, the development of efficient and safe CAR-T cells for the treatment of ES is still challenging due to i) the low abundance of specific TAA, ii) the widespread expression of TAA in normal tissues, leading to on-target off-tumour toxicities iii) and the presence of an immunosuppressive tumour microenvironment (iTME) that reduces CAR-T cells expansion and persistence at tumour sites. Here, we show preliminary data from ES cell lines and primary samples aiming to identify specific ES-targets with limited expression in healthy tissues to try to generate an efficient and safe CAR-T cell approach for treating metastatic and refractory ES.

Background Endometrial cancer (EC) is the most prevalent gynecological cancer and it can be categorized into four molecular subtypes; ultramutated POLE, hypermutated MSI, CNL and CNH. To date, the prevalence, specificity and phenotype of tumor infiltrating lymphocytes (TILs), and their exact role in EC remain controversial. Thus, a thorough investigation deciphering the phenotypic landscape of EC-infiltrating T lymphocytes and their anti-tumor reactivity is still missing. Methods In order to study the implications of the T-cells infiltrating EC for prognosis or susceptibility to immune checkpoint inhibitors, we analyzed the phenotypic traits of CD8 and CD4 EC-resident T cells from single-cell suspensions (n=47) by multicolor flow cytometry (19 biomarkers). Correlation analyses between the phenotype of the TILs, EC molecular subgroups and the survival of the patients were performed to identify biomarkers that could predict prognosis or survival. This identification guided the isolation of specific CD8 and CD4 subpopulations based on the differential expression of the selected biomarkers to evaluate their ability to recognize tumor (figure 1). Results Our analysis evidenced the presence of CD8+ and CD4+ T cells with distinct levels of PD-1 expression: cells that did not express PD-1 (PD-1-), cells expressing intermediate (PD-1dim) or high (PD-1hi) levels of PD-1. We found that TIM-3+, CD39+, CXCL13+, BCL6+ or Ki67+ cells frequently co-expressed almost exclusively on the PD-1hi, but not on the PD-1- or dim CD8+ TILs. On the other hand, CD4+ TILs displayed co-expression of TIM-3, CD103, CD39, CD38, HLA-DR, CXCL13, BCL6, CXCR5 or Ki67 within the PD-1hi, but also PD-1dim cells. Importantly, our data shows that the frequency of PD-1hi or CD39+ CD8+ EC TILs, and of PD-1hi but not CD39+ CD4+ TILs was associated with improved survival. Of the 5 predominant CD8+ tumor-resident subpopulations observed (PD-1-CD39-, PD-1dimCD39-, PD-1dimCD39+, PD-1hiCD39- and PD-1hiCD39+) the PD-1hiCD39+, but not the PD-1hiCD39- lymphocytes, harbored the highest frequency of autologous tumor-reactive lymphocytes in all four EC tumors studied. However, both the CD4+ PD-1hiCD39+ and the PD-1hiCD39- contained autologous tumor-reactive lymphocytes in all four tumors screened; being the PD-1hiCD39+ cells the subpopulation containing the majority of tumor-reactive CD4+ cells. Abstract 61 Figure 1 Schematic workflow of the study. A section of a primary EC tumor resection is digested and stained with specific antibodies to characterize the phenotype of CD8 and CD4 TILs by flow cytometry (upper panel). Targeted sequencing and IHC including typically altered genes in EC are performed in order to molecularly classify the patient‘s cohort into different disease subgroups. Combining the data generated by flow cytometry, targeted sequencing and IHC, specific biomarkers on CD8 and CD4 TILs are investigated for their potential role in predicting molecular subtypes or survival (middle panel). CD8 and CD4 TILs are isolated from the tumor digest based on the differential expression of PD-1 and CD39 and the specific isolated CD8 and CD4 subpopulations are cultured in vitro to expand them to large numbers. The expanded CD8 and CD4 subpopulations are subsequently screened for tumor recognition by co-culturing the isolated subpopulations with autologous tumor cell lines. Tumor recognition is assessed by measuring the up-regulation of the activation markers 4-1BB or OX40 on CD8+ or CD4+ T cells, respectively, by flow cytometry, and by measuring IFN-γ production by ELISPOT. Conclusions Overall, our data suggest that CD39 expression on CD8+PD-1hi EC-resident T cells defines a tumor-reactive population that plays an important role in protecting patients from recurrence after surgery. However, PD-1 expression but not CD39 on CD4+ TILs, better guides the identification of lymphocyte subsets with enriched tumor-recognition potential that contribute to improved clinical benefit in EC. Ethics Approval This study was approved by the ‘Comité de Ética de Investigación con Medicamentos del Hospital Universitario Vall d’Hebron’ institution’s Ethics Board; approval number PR(AG)537/2019.