The world is dealing with one of the worst pandemics ever. SARS-CoV-2 is the etiological agent of COVID-19 that has already spread to more than 200 countries. However, infectivity, severity, and mortality rates do not affect all countries equally. Here we consider 140 HLA alleles and extensively investigate the landscape of 3,723 potential HLA-I A and B restricted SARS-CoV-2-derived antigens and how 37 countries in the world are predicted to respond to those peptides considering their HLA-I distribution frequencies. The clustering of HLA-A and HLA-B allele frequencies partially separates most countries with the lowest number of deaths per million inhabitants from the other countries. We further correlated the patterns of in silico predicted population coverage and epidemiological data. The number of deaths per million inhabitants correlates to the predicted antigen coverage of S and N derived peptides and its module is influenced if a given set of frequent or rare HLA alleles are analyzed in a given population. Moreover, we highlighted a potential risk group carrying HLAs associated with an elevated number of deaths per million inhabitants. In addition, we identified three potential antigens bearing at least one amino acid of the four-length insertion that differentiates SARS-CoV-2 from previous coronavirus strains. We believe these data can contribute to the search for peptides with the potential to be used in vaccine strategies considering the role of herd immunity to hamper the spread of the disease. Importantly, to the best of our knowledge, this work is the first to use a populational approach in association with COVID-19 outcome.

Abstract Esophageal squamous cell carcinoma (ESCA) exhibits high intratumoral molecular heterogeneity posing a challenge to cancer therapy. Immune checkpoint blockade therapy has been approved for this disease, but with modest results. RNA-Seq data from paired tumor and surrounding nonmalignant tissue from 14 patients diagnosed with ESCA without previous treatment and from The Cancer Genome Atlas-ESCA cohort were analyzed. Herein, we investigated ESCA immune landscape including mutation-derived neoantigens and immune cell subpopulations. Tumor-associated antigen expression was determined by in silico analyses and confirmed by immunohistochemistry showing that PRAME, CEACAM4, and MAGEA11 proteins are expressed on tumors. Immune checkpoint molecules gene expression was higher in the tumor compared with surrounding nonmalignant tissue, but its expression varies greatly among patients. TCR repertoire and BCR transcripts analysis evidenced low clonal diversity with one TCR clone predicted to be specific for a MAGEA11-derived peptide. A high number of B-cell clones infiltrating the tumors and the abundance of these cells in tertiary lymphoid structures observed in ESCA tumors support B cells as a potential immune modulator in this tumor.

The immunologic landscape of tumors has been continuously unveiled, providing a new look at the interactions between cancer cells and the immune system.Emerging tumor cells are constantly eliminated by the immune system, but some cells establish a long-term equilibrium phase leading to tumor immunoediting and, eventually, evasion.During this process, tumor cells tend to acquire more mutations.Bearing a high mutation burden leads to a greater number of neoantigens with the potential to initiate an immune response.Although many tumors evoke an immune response, tumor clearance by the immune system does not occur due to a suppressive tumor microenvironment.The mechanisms by which tumors achieve the ability to evade immunologic control vary.Understanding these differences is crucial for the improvement and application of new immune-based therapies.Much effort has been placed in developing in silico algorithms to predict tumor immunogenicity and to characterize the microenvironment via high-throughput sequencing and gene expression techniques.Each sequencing source, transcriptomics, and genomics yields a distinct level of data, helping to elucidate the tumor-based immune responses and guiding the fine-tuning of current and upcoming immune-based therapies.In this review, we explore some of the immunological concepts behind the new immunotherapies and the bioinformatic tools to study the immunological aspects of tumors, focusing on neoantigen determination and microenvironment deconvolution.We further discuss the immune-based therapies already in clinical use, those underway for future clinical application, the next steps in immunotherapy, and how the characterization of the tumor immune contexture can impact therapies aiming to promote or unleash immune-based tumor elimination.

Introduction:Oral cavity tumors are the 5th more frequent neoplasms among men according to INCA's last estimative.The occurrence of metastatic processes during tumor development increases the chances of relapse and hamper the treatment.That said, studying the mechanisms that favour metastasis may help identifying biomarkers associated with this process and ultimately improve treatment. Objective:To analyze in silico the HPV-negative tumors from oral cavity comparing those which and without linfonodal metastasis.Methodology: 20 samples from a collaborator's cohort (AC Camargo -ACC) and 22 samples from The Cancer Genome Atlas (TCGA) were analyzed.The raw data from ACC was filtered and quality checked using FastQC and Trimmomatic, respectively.The ACC reads were then aligned against the human genome GRCh38 using star method and genes were counted with RSEM package.TCGA cohort already possess pre-processed data.Differentially expressed genes were evaluated by DESeq2, the enriched pathways by Webgestalt and tumor microenvironment by xCell.Exclusively for the TCGA available data, the HLA-I alleles were identified by Optitype and subsequent neoantigen prediction was accomplished by netMHCpan.T and B-cell receptors (TCR and BCR) repertoire were identified and analyzed by MiXCR. Results:We identified 186 DEG for the TCGA cohort, 127 for the ACC and 3 DEG shared genes, from which two of them up-regulated in the same condition: PIWIL2 (up-regulated in the non metastatic group) and ADH1B (up-regulated in the metastatic group).The immune population with the highest correlation coefficient was the memory CD4 T-cell (Pearson: -0,78 in ACC and -0,71 in TCGA) which signature is enriched in the non metastatic group.A prolymphocyte B signature had an elevated correlation coefficient (Pearson: 0,77 in TCGA cohort) with the metastatic outcome.A higher clone number of TCR alpha (p<0,01) and beta (p<0,001) chains was identified in the non metastatic group.There was no difference between mutation and neoantigen load between groups.Moreover, the sample with higher mutation burden was also the solely bearing a damaging mutation in the antigen processing and presentation pathway.In total, 4 samples had mutations in DNA repair pathways, representing the 4 with higher neoantigen burden.Pathway enrichment analysis as well as correlations between immune populations are currently underway. Conclusion:The results suggest an association between memory CD4 T-cells and metastasisfree disease.The individual analysis of each sample indicates putative mechanisms of immune escape, for example, the mutated protein in the antigen processing and presentation pathway.

Introduction: Inhibitory receptors such as PD-1, LAG-3 and CTLA-4 have gained special attention as potential targets for immunotherapy, since manipulation of negative signals mediated by these receptors may provide new therapeutic options for several diseases, as cancer.LAG-3 was described as a cell surface molecule interacting with MHC class II molecules.Identifying how proteins transduce the signal from these receptors has been a challenge but, once identified, these molecules can also be targets for novel therapeutics.In 2012, a method called BioID was developed based on the fusion of a protein of interest to a mutated biotin ligase (R118G), which has the ability to add biotin to molecules that are at 20 nm or less from the protein of interest.Once biotinylated, the proteins can be recovered and identified by mass spectrometry.Objective: To perform a screening of proteins interacting with LAG-3 through the BioID method.Methodology: chimeric antigen receptors (CARs) were constructed with the anti-CD20 scFv fused to the intracellular domains consisting of: Lag-3 WT, Lag-3 Kmut, Lag3 EPdel (deleted EP domain), all fused to the BirA domain, with further induction of expression in the HEK293T and Jurkat cell lines.Flow cytometry analysis will be performed to verify the CAR's expression in the cells, and immunofluorescence assay to analyze the localization of the CARs. Results:The CAR anti-CD20/Lag3 WT-BirA was electroporated in the HEK293T cells presenting 80% of expression.CARs Ep del and Kmut showed 39% and 41% of CAR expression.By immunofluorescence staining it was possible to observe the cytoplasmatic localization of the CARs.Analysis of the biotinylation pattern by Western blotting was performed for CAR anti-CD20/Lag3WT-BirA, and the expected ladder pattern of biotinylation was observed. Conclusion:The constructed CARs were expressed in the target cell lines leading to the expected biotinilated patterns.

Abstract Introduction: Inhibitory receptors, such as PD-1, LAG-3, TIM-3, and CTLA-4, have gained attention as potential targets for immunotherapy, once the manipulation of the negative signals mediated by these receptors may provide new therapeutic approaches for both infectious diseases, transplantation, autoimmune diseases such as for cancer. More recently, CD-4 likelymphocyte activation gene-3 (LAG-3) was described as a cell surface molecule that interacts with high affinity through its cytoplasmic domain with MHC class II molecules. Recently, in addition to these inhibitory receptors, to identify which molecules interact with these has been the new goal of this area. Once identified, such molecules can also become possible new targets to be achieved. In 2012, in order to identify interactions between proteins dependent proximity shape and biotinylation, Roux et al. (2012) developed a method called BioID, wich is based on the fusion of a protein of interest linked to a mutated biotinaligase (R118G) from Escherichia coli, which is called BirA (Choi-Rhee et al., 2004; Cronan, 2005; Roux et al., 2012.) This enzyme is able to biotinylate proteins associated with particular target protein. Once biotinylated, the proteins may be recovered by affinity (Kd = 10-14) through beads conjugated to streptavidin and subsequently identified by mass spectrometry. Objective: To conduct a screening of proteins that interact with LAG-3 by BioID method and identify the possible signaling pathways (in silico analysis) with which these proteins are involved, validate the presence of the same by Western blot and/or flow cytometry, and relate data obtained by increasing or decreasing the immune response by T cells. Methodology: To simulate the activation of LAG-3, we will build chimeric receptors with extracellular domain scFv anti-CD20 (chimeric receptor antigen - CAR) containing intracellular domain of Lag-3 wild type, Lag-3 Kmut (mutation K =&gt; Non KIEELE ), Lag3 EPdel (EP domain deleted), and Lag-3 Kmut EPdel (double mutant), all fused to the BirA domain. Subsequently we induce expression of these CARs cells in HEK293FT and CD4 + T lymphocyte Jurkat 20BBz +. Then we perform the identification and quantification of proteins associated to the inhibitory receptor Lag-3 by mass spectrometry, as well as perform in silico analysis of possible downstream signaling pathways in which Lag3 is involved. Preliminary results: To date, all vectors have been cloned and to test the system, only a few attempts, only CAR antiCD20/Lag3 Wild Type-BirA was electroporated in the HEK293T cell line, presenting 75% and 90% of expression. Western blotting was performed to verify biotinylation (incubation with Pierce™ High Sensitivity Streptavidin-HRP) and the presence of CAR (incubation with anti-Fab antibody), confirming the recruitment of molecules by the Lag-3 receptor. Perspectives: Electroporate the remaining CARs in both HEK293T and Jurkat, double-check the presence of CAR and biotinylation pattern in all conditions, as well as proceed to an identification and quantification of proteins by mass spectrometry and validate the presence of proteins identified by flow cytometry and/or Western blot. Citation Format: Priscila Rafaela/P. R. Ribeiro, Martin Bonamino, Leonardo Chycaibam, Marco Pretti. Screening of proteins related to the inhibitory receptor lymphocyte activation gene-3 (LAG-3) through BioID method [abstract]. In: Proceedings of the AACR International Conference held in cooperation with the Latin American Cooperative Oncology Group (LACOG) on Translational Cancer Medicine; May 4-6, 2017; São Paulo, Brazil. Philadelphia (PA): AACR; Clin Cancer Res 2018;24(1_Suppl):Abstract nr A41.