The Wnt, Hedgehog, and Notch pathways are inherent signaling pathways in normal embryogenesis, development, and hemostasis. However, dysfunctions of these pathways are evident in multiple tumor types and malignancies. Specifically, aberrant activation of these pathways is implicated in modulation of cancer stem cells (CSCs), a small subset of cancer cells capable of self-renewal and differentiation into heterogeneous tumor cells. The CSCs are accountable for tumor initiation, growth, and recurrence. In this review, we focus on roles of Wnt, Hedgehog, and Notch pathways in CSCs’ stemness and functions and summarize therapeutic studies targeting these pathways to eliminate CSCs and improve overall cancer treatment outcomes.

Cancer is a condition that has plagued humanity for thousands of years, with the first depictions dating back to ancient Egyptian times. However, not until recent decades have biological therapeutics been developed and refined enough to safely and effectively combat cancer. Three unique immunotherapies have gained traction in recent decades: adoptive T cell transfer, checkpoint inhibitors, and bivalent antibodies. Each has led to clinically approved therapies, as well as to therapies in preclinical and ongoing clinical trials. In this review, we outline the method by which these 3 immunotherapies function as well as any major immunotherapeutic drugs developed for treating a variety of cancers.

Viral infections remain a global public health concern and cause a severe societal and economic burden. At the organismal level, the innate immune system is essential for the detection of viruses and constitutes the first line of defense. Viral components are sensed by host pattern recognition receptors (PRRs). PRRs can be further classified based on their localization into Toll-like receptors (TLRs), C-type lectin receptors (CLR), retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I)-like receptors (RLRs), NOD-like receptors (NLRs) and cytosolic DNA sensors (CDS). TLR and RLR signaling results in production of type I interferons (IFNα and -β) and pro-inflammatory cytokines in a cell-specific manner, whereas NLR signaling leads to the production of interleukin-1 family proteins. On the other hand, CLRs are capable of sensing glycans present in viral pathogens, which can induce phagocytic, endocytic, antimicrobial, and pro- inflammatory responses. Peripheral immune sensing of viruses and the ensuing cytokine response can significantly affect the central nervous system (CNS). But viruses can also directly enter the CNS via a multitude of routes, such as the nasal epithelium, along nerve fibers connecting to the periphery and as cargo of infiltrating infected cells passing through the blood brain barrier, triggering innate immune sensing and cytokine responses directly in the CNS. Here, we review mechanisms of viral immune sensing and currently recognized consequences for the CNS of innate immune responses to viruses.

People living with HIV (PLWH) continue to develop HIV-associated neurocognitive disorders despite combination anti-retroviral therapy. Lipocalin-2 (LCN2) is an acute phase protein that has been implicated in neurodegeneration and is upregulated in a transgenic mouse model of HIV-associated brain injury. Here we show that LCN2 is significantly upregulated in neocortex of a subset of HIV-infected individuals with brain pathology and correlates with viral load in CSF and pro-viral DNA in neocortex. However, the question if LCN2 contributes to HIV-associated neurotoxicity or is part of a protective host response required further investigation. We found that the knockout of LCN2 in transgenic mice expressing HIVgp120 in the brain (HIVgp120tg) abrogates behavioral impairment, ameliorates neuronal damage, and reduces microglial activation in association with an increase of the neuroprotective CCR5 ligand CCL4. In vitro experiments show that LCN2 neurotoxicity also depends on microglia and p38 MAPK activity. Genetic ablation of CCR5 in LCN2-deficient HIVgp120tg mice restores neuropathology, suggesting that LCN2 overrides neuroprotection mediated by CCR5 and its chemokine ligands. RNA expression of 168 genes involved in neurotransmission reveals that neuronal injury and protection are each associated with genotype- and sex-specific patterns affecting common neural gene networks. In conclusion, our study identifies LCN2 as a novel factor in HIV-associated brain injury involving CCR5, p38 MAPK and microglia. Furthermore, the mechanistic interaction between LCN2 and CCR5 may serve as a diagnostic and therapeutic target in HIV patients at risk of developing brain pathology and neurocognitive impairment.

Canine Atopic Dermatitis (AD) is a common complex and multifactorial disease involving immune dysregulation, genetic predisposition, skin barrier defects, environmental factors and allergic sensitization. To date, diagnosis of canine AD relies on a combination of patient history, clinical examination, allergy testing and response to diet trials/therapies with no reliable biomarkers available to distinguish AD from other diseases with similar clinical presentations. A handful of studies to identify potential biomarkers in the peripheral blood of AD dogs and healthy controls have been performed with some showing inconsistent and contradictory results. In this study, we, for the first time, report statistically significant increases in expression of phosphodiesterase 4D (PDE4D) gene in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and miR-203 in plasma from AD dogs compared to healthy controls. In addition, we report a statistically non-significant change of the CD4+/CD8+ ratio, a dramatic decrease of three gene markers (PIAS1, RORA and SH2B1) as well as a panel of differential expression of cytokines in AD dogs in comparison to the healthy controls. Our study provides important insight into the complexities of canine AD, and further studies to verify the specificity of these findings for canine AD at a larger-scale are warranted.

Abstract Counting cells is a cornerstone of tracking disease progression in neuroscience. A common approach for this process is having trained researchers individually select and count cells within an image, which is not only difficult to standardize but also very time-consuming. While tools exist to automatically count cells in images, the accuracy and accessibility of such tools can be improved. Thus, we introduce a novel tool ACCT: Automatic Cell Counting with Trainable Weka Segmentation which allows for flexible automatic cell counting via object segmentation after user-driven training. ACCT is demonstrated with a comparative analysis of publicly available images of neurons and an in-house dataset of immunofluorescence-stained microglia cells. For comparison, both datasets were manually counted to demonstrate the applicability of ACCT as an accessible means to automatically quantify cells in a precise manner without the need for computing clusters or advanced data preparation.

Abstract Counting cells is a cornerstone of tracking disease progression in neuroscience. A common approach for this process is having trained researchers individually select and count cells within an image, which is not only difficult to standardize but also very time-consuming. We present an automatic cell counting methodology which leverages the Trainable WEKA Segmentation (TWS) plugin available in the FIJI distribution of ImageJ (Schindelin 2012, Schneider 2012). TWS provides access to machine learning tools for object segmentation with an accessible graphical user interface. However, to analyze whole datasets requires further automation through the use of macros which we constructed within ImageJ maintain this high level of accessibility. We compared our automatic counts to a published, hand counted dataset of Immunofluorescence stained mouse cortex microglia (Singh et al. 2020). For this analysis we used a wild-type (WT) control and a transgenic mouse model for HIV-induced brain injury (HIVgp120). HIVgp120 mice showed behavioral deficits, and increase in microglia numbers presumably caused the gp120 protein. 10X images were collected in the sagittal plane from brain slices of three 11–14 month-old male mice for each genotype. The auto counting strategy with TWS replicated the increase in mean microglial density in images from the HIVgp120 mice (Manual p =0.0001; Auto p=0.0002). The auto count also correlates significantly with the manual counts in both genotypes (WT p= 2.297 e−07, adj. R2= 0.65; HIVgp120 p=2.591 e−04 adj. R2=0.423). The auto counting strategy took less than a fifth of the time for the expert manual count, allowing for the efficient exploration of large sets of image data.

Abstract 37 million people worldwide are diagnosed with Human Immunodeficiency Virus (HIV). An estimated 15–55% of these individuals develop HIV-associated neurocognitive disorder (HAND). Previous studies, including work in our lab identifies a transient increase of interferon beta (IFNβ), an anti-inflammatory and anti-viral type 1 interferon, preceding any behavioral or neuropathological signs in the HIVgp120 transgenic mouse and Simian Immunodeficiency Virus (SIV) models, suggesting a neuroprotective role for IFNβ in early HIV infection. We have previously shown that exogenous intranasal IFNβ treatment is sufficient to confer neuronal protection in HIVgp120 transgenic mice. However, the mechanism by which IFNβ mediates neuroprotection remains unclear. Here we focus primarily on the microglial contribution to IFNβ mediated neuroprotection, as HIV productively infects macrophage/microglia in the CNS. In this study, we show that abrogating IFNβ down regulates expression of viral sensor, RIG-I, as well as interferon regulatory factors, IRF9, and most robustly IRF7 in the cortex of IFNβ KO HIVgp120tg mice. In addition, using the HMC3 human microglial cell line we show a robust dose dependent increase in innate immune anti-viral genes including IRF7, IFIT1, GBP1 and GBP4. Beyond its anti-viral effects, IFNβ treated microglia are potent inducers of the neuroprotective beta chemokines MIP-1a (CCL3), MIP-1b (CCL4) and RANTES (CCL5). Taken together, this data suggests that IFNβ may be conferring neuroprotection through microglial specific induction of anti-viral genes and neuroprotective beta chemokines CCL3, -4 and -5.

Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) infects the central nervous system (CNS) and causes HIV-associated neurocognitive disorders (HAND) in about half of the population living with the virus despite combination anti-retroviral therapy (cART). HIV-1 activates the innate immune system, including the production of type 1 interferons (IFNs) α and β. Transgenic mice expressing HIV-1 envelope glycoprotein gp120 (HIVgp120tg) in the CNS develop memory impairment and share key neuropathological features and differential CNS gene expression with HIV patients, including the induction of IFN-stimulated genes (ISG). Here we show that knocking out IFNβ (IFNβKO) in HIVgp120tg and non-tg control mice impairs recognition and spatial memory, but does not affect anxiety-like behavior, locomotion, or vision. The neuropathology of HIVgp120tg is only moderately affected by the KO of IFNβ but in a sex-dependent fashion. Notably, in cerebral cortex of IFNβKO animals presynaptic terminals are reduced in males while neuronal dendrites are reduced in females. The IFNβKO results in the hippocampal CA1 region of both male and female HIVgp120tg mice in an ameliorated loss of neuronal presynaptic terminals but no protection of neuronal dendrites. Only female IFNβ-deficient HIVgp120tg mice display diminished microglial activation in cortex and hippocampus and increased astrocytosis in hippocampus compared to their IFNβ-expressing counterparts. RNA expression for some immune genes and ISGs is also affected in a sex-dependent way. The IFNβKO abrogates or diminishes the induction of MX1, DDX58, IRF7 and IRF9 in HIVgp120tg brains of both sexes. Expression analysis of neurotransmission related genes reveals an influence of IFNβ on multiple components with more pronounced changes in IFNβKO females. In contrast, the effects of IFNβKO on MAPK activities are independent of sex with pronounced reduction of active ERK1/2 but also of active p38 in the HIVgp120tg brain. In summary, our findings show that the absence of IFNβ impairs memory dependent behavior and modulates neuropathology in HIVgp120tg brains, indicating that its absence may facilitate development of HAND. Moreover, our data suggests that endogenous IFNβ plays a vital role in maintaining neuronal homeostasis and memory function.

Abstract Magnetic cell sorting has been widely used to isolate different cell types as it is a fast and reliable method to obtain discrete populations with high purity and yield. However, to maintain cell functionality with this approach has been concerned for different studies. To address this, the cells were isolated with our recently developed MojoSort™ isolation kit using commercially available magnetic cell separation column, and compared that with other commercial magnetic column related products. The stickiness of the magnetic particles of those isolated cells were then imaged with electron microscope, and the cellular functionality was tested by activation of MAPK/ERK pathway and cell proliferation assay. Our data show that MojoSort™ negative isolated cells with MojoSort™ separator or magnetic column do not display beads on cell surface, phosphorylation of ERK1/2 level did not increase as detected by western blot, and the isolated cells showed fully functional. In addition, both positively isolated cells with either MojoSort™ kit or magnetic separation column related kit preserved functionality. Furthermore, MojoSort™ isolated cells only have <10% of particles covered on the cell surface. Finally, when analyzing positively selected cells using MojoSort™ kit with MojoSort™ magnet, we observed a higher number of beads on the cell surface as compared to cells isolated using separation columns, but the cells still maintain their functionality. Thus, our data demonstrates that cells isolated with MojoSort™ reagents are viable and functional, independently of the magnetic separator used, either column-based or handheld magnet.