Schizophrenia has been defined as a neurodevelopmental disease that causes changes in the process of thoughts, perceptions, and emotions, usually leading to a mental deterioration and affective blunting. Studies have shown altered cell respiration and oxidative stress response in schizophrenia; however, most of the knowledge has been acquired from postmortem brain analyses or from nonneural cells. Here we describe that neural cells, derived from induced pluripotent stem cells generated from skin fibroblasts of a schizophrenic patient, presented a twofold increase in extramitochondrial oxygen consumption as well as elevated levels of reactive oxygen species (ROS), when compared to controls. This difference in ROS levels was reverted by the mood stabilizer valproic acid. Our model shows evidence that metabolic changes occurring during neurogenesis are associated with schizophrenia, contributing to a better understanding of the development of the disease and highlighting potential targets for treatment and drug screening.

Gene transfer to T lymphocytes has historically relied on retro and lentivirus, but recently transposon-based gene transfer is rising as a simpler and straight forward approach to achieve stable transgene expression. Transfer of expression cassettes to T lymphocytes remains challenging, being based mainly on commercial kits. Aims We herein report a convenient and affordable method based on in house made buffers, generic cuvettes and utilization of the widely available Lonza nucleofector II device to promote efficient gene transfer to T lymphocytes. Results This approach renders high transgene expression levels in primary human T lymphocytes (mean 45%, 41–59%), the hard to transfect murine T cells (mean 38%, 36–42% for C57/BL6 strain) and human Jurkat T cell line. Cell viability levels after electroporation allowed further manipulations such as in vitro expansion and Chimeric Antigen Receptor (CAR) mediated gain of function for target cell lysis. Conclusions We describe here an efficient general protocol for electroporation based modification of T lymphocytes. By opening access to this protocol, we expect that efficient gene transfer to T lymphocytes, for transient or stable expression, may be achieved by an increased number of laboratories at lower and affordable costs.

Gene therapy protocols require robust and long-term gene expression. For two decades, retrovirus family vectors have offered several attractive properties as stable gene-delivery vehicles. These vectors represent a technology with widespread use in basic biology and translational studies that require persistent gene expression for treatment of several monogenic diseases. Immunogenicity and insertional mutagenesis represent the main obstacles to a wider clinical use of these vectors. Efficient and safe non-viral vectors are emerging as a promising alternative and facilitate clinical gene therapy studies. Here, we present an updated review for beginners and expert readers on retro and lentiviruses and the latest generation of transposon vectors (sleeping beauty and piggyBac) used in stable gene transfer and gene therapy clinical trials. We discuss the potential advantages and disadvantages of these systems such as cellular responses (immunogenicity or genome modification of the target cell) following exogenous DNA integration. Additionally, we discuss potential implications of these genome modification tools in gene therapy and other basic and applied science contexts.

Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are patient T cells that are transduced with genetically engineered synthetic receptors to target a cancer cell surface antigen. The remarkable clinical response rates achieved by adoptive transfer of T cells that target CD19 in patients with leukemia and lymphoma have led to a growing number of clinical trials exploring CAR T-cell therapy for solid tumors. Herein, we review the evolution of adoptive T-cell therapy; highlight advances in CAR T-cell therapy for thoracic malignancies; and summarize the targets being investigated in clinical trials for patients with lung cancer, malignant pleural mesothelioma, and esophageal cancer. We further discuss the barriers to successfully translating CAR T-cell therapy for solid tumors and present strategies that have been investigated to overcome these hurdles.

Genetic modification of cell lines and primary cells is an expensive and cumbersome approach, often involving the use of viral vectors. Electroporation using square wave generating devices, like Lonza´s Nucleofector, is a widely used option, but the costs associated with the acquisition of electroporation kits and the transient transgene expression might hamper the utility of this methodology. In the present work we show that our in house developed buffers, termed Chicabuffers, can be efficiently used to electroporate cell lines and primary cells from murine and human origin. Using the Nucleofector II device, we electroporated 14 different cell lines and also primary cells, like mesenchymal stem cells and cord blood CD34+, providing optimized protocols for each of them. Moreover, when combined with Sleeping Beauty based transposon system, long-term transgene expression could be achieved in all types of cells tested. Transgene expression was stable and did not interfere with CD34+ differentiation to committed progenitors. We also show that these buffers can be used in CRISPR-mediated editing of PDCD1 gene locus in 293T and human peripheral blood mononuclear cells. The optimized protocols reported in this study provide a suitable and cost-effective platform for the genetic modification of cells, facilitating the widespread adoption of this technology.

Flavonoids have key functions in the regulation of multiple cellular processes; however, their effects have been poorly examined in pluripotent stem cells. Here, we tested the hypothesis that neurogenesis induced by all-trans retinoic acid (RA) is enhanced by agathisflavone (FAB, Caesalpinia pyramidalis Tull). Mouse embryonic stem (mES) cells and induced pluripotent stem (miPS) cells growing as embryoid bodies (EBs) for 4 days were treated with FAB (60 μM) and/or RA (2 μM) for additional 4 days. FAB did not interfere with the EB mitotic rate of mES cells, as evidenced by similar percentages of mitotic figures labeled by phospho-histone H3 in control (3.4%±0.4%) and FAB-treated groups (3.5%±1.1%). Nevertheless, the biflavonoid reduced cell death in both control and RA-treated EBs from mES cells by almost 2-fold compared with untreated EBs. FAB was unable, by itself, to induce neuronal differentiation in EBs after 4 days of treatment. On the other hand, FAB enhanced neuronal differentiation induced by RA in both EBs of mES and miPS. FAB increased the percentage of nestin-labeled cells by 2.7-fold (mES) and 2.4 (miPS) and β-tubulin III–positive cells by 2-fold (mES) and 2.7 (miPS) in comparison to RA-treated EBs only. FAB increased the expression of RA receptors α and β in mES EBs, suggesting that the availability of RA receptors is limiting RA-induced neurogenesis in pluripotent stem cells. This is the first report to describe that naturally occurring biflavonoids regulate apoptosis and neuronal differentiation in pluripotent stem cells.

Sexually transmitted diseases (STD) are frequently asymptomatic and increase the likelihood of transmitting and acquiring HIV. In Brazil, the guidelines for STDs diagnosis and treatment are based on the syndromic approach. Nucleic acid amplification tests (NAAT) has been recommended as routine STDs screening in some countries, especially for men who have sex with men (MSM). Limited data are available about how to best define target groups for routine screening by NAATs within this population. We aimed to assess the prevalence of rectal and urethral Chlamydia trachomatis (CT) and Neisseria gonorrhoeae (NG) infections and syphilis, and the factors associated with having at least one STD among HIV-infected and uninfected MSM in Rio de Janeiro, Brazil. From August 2010 to June 2012, 391 MSM were enrolled into the Evandro Chagas National Institute of Infectious Diseases-INI-Fiocruz cohort, and 292 MSM (HIV-infected:211 and HIV-uninfected:81) were included in this study. NAATs were performed on the rectal swabs and urine for CT and NG. The rapid plasma reagin test and microhemagglutination assay for Treponema pallidum were performed for syphilis diagnosis. The overall prevalence of STD was 20.0 % (95%CI:15.7-25.1): 10 % anorectal chlamydia; syphilis 9.9 %; anorectal gonorrheae 2.5 %; and urethral chlamydia 2.2 %; no case of urethral gonorrheae was detected. The proportion of HIV-positive MSM who had at least one STD was nearly two times that of HIV-negative MSM (22.6 % vs 13.2 %; P = 0.09). The frequency of each STD, except for anorectal NG (1.5 % vs.5.2 %), was higher among HIV-positive than HIV-negative individuals. Among the 211 asymptomatic participants, 17.5 % (n = 37) were identified as having at least one STD; 10.4 % (n = 22/211) tested positive for anorectal chlamydia. Sixty five percent of HIV-positive MSM were asymptomatic at the time of the STD diagnosis, while 100.0 % of the HIV-negative MSM. Age (APR = 0.78; 95%CI:0.60-1.00 for each additional ten years) and a positive-HIV serostatus (APR = 2.05; 95%CI:1.03-4.08) were significantly associated with STD diagnosis. An overall high STD-prevalence rate was observed, especially among HIV-infected and in younger individuals, and the majority of STDs were asymptomatic. STD screening using NAATs among asymptomatic MSM is a potentially cost-effective intervention for the prevention of HIV infection among MSM.

The existence of loss and gain of chromosomes, known as aneuploidy, has been previously described within the central nervous system. During development, at least one-third of neural progenitor cells (NPCs) are aneuploid. Notably, aneuploid NPCs may survive and functionally integrate into the mature neural circuitry. Given the unanswered significance of this phenomenon, we tested the hypothesis that neural differentiation induced by all-trans retinoic acid (RA) in pluripotent stem cells is accompanied by increased levels of aneuploidy, as previously described for cortical NPCs in vivo. In this work we used embryonal carcinoma (EC) cells, embryonic stem (ES) cells and induced pluripotent stem (iPS) cells undergoing differentiation into NPCs. Ploidy analysis revealed a 2-fold increase in the rate of aneuploidy, with the prevalence of chromosome loss in RA primed stem cells when compared to naïve cells. In an attempt to understand the basis of neurogenic aneuploidy, micronuclei formation and survivin expression was assessed in pluripotent stem cells exposed to RA. RA increased micronuclei occurrence by almost 2-fold while decreased survivin expression by 50%, indicating possible mechanisms by which stem cells lose their chromosomes during neural differentiation. DNA fragmentation analysis demonstrated no increase in apoptosis on embryoid bodies treated with RA, indicating that cell death is not the mandatory fate of aneuploid NPCs derived from pluripotent cells. In order to exclude that the increase in aneuploidy was a spurious consequence of RA treatment, not related to neurogenesis, mouse embryonic fibroblasts were treated with RA under the same conditions and no alterations in chromosome gain or loss were observed. These findings indicate a correlation amongst neural differentiation, aneuploidy, micronuclei formation and survivin downregulation in pluripotent stem cells exposed to RA, providing evidence that somatically generated chromosomal variation accompanies neurogenesis in vitro.

CAR-T-cell therapy has shown considerable advance in recent years, being approved by regulatory agencies in US, Europe, and Japan for the treatment of refractory patients with CD19+ B-cell leukemia or diffuse large B-cell lymphoma. Current methods for CAR-T-cell production use viral vectors for T-cell genetic modification and can take up to 15 days to generate the infusion product. The development of simple and less costly manufacturing protocols is needed in order to meet the increasing demand for this therapy. In this present work, we generated 19BBz CAR-T cells in 8 days using a protocol based on the non-viral transposon-based vector Sleeping Beauty. The expanded cells display mostly a central memory phenotype, expressing higher levels of inhibitory receptors when compared with mock cells. In addition, CAR-T cells were cytotoxic against CD19+ leukemia cells in vitro and improved overall survival rates of mice xenografted with human RS4;11 or Nalm-6 B-cell leukemias. Infused CAR-T cells persisted for up to 28 days, showing that they are capable of long-term persistence and antitumor response. Altogether, these results demonstrate the effectiveness of our protocol and pave the way for a broader application of CAR-T-cell therapy.

Chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunotherapy for the treatment of cancer is now an approved treatment for B cell malignancies. However, the use of viral vectors to provide long-term CAR expression is associated with high production costs and cumbersome quality controls, impacting the final cost of CAR T cell therapies. Nonviral integrative vectors, such as Sleeping Beauty (SB) transposons, provide an alternative to modify primary T cells. Therefore, we developed a protocol to expand SB-transfected 19BBζ CAR T cells using a lymphoblastoid cell line, and evaluated T cell phenotype as well as function along the T cell expansion. Electroporation of PBMCs with transposon plasmid decreased cell viability on day 1 but had a minor impact on the frequency of memory subpopulations when compared to mock condition. CAR+ lymphocytes showed increased proliferation compared to mock control and high cytotoxic activity towards CD19+ cells without significant differences in exhaustion markers expression. Moreover, CAR+ lymphocytes showed an increased frequency by the end of the stimulation cycle compared with day 1, suggesting that CAR expression confers a selective proliferation advantage. Immunodeficient NOD scid gamma chain knockout (NSG) mice engrafted with the human pre-B leukemic cell line RS4;11 and treated with 19BBζ CAR T cells showed improved overall survival when compared to mock T cells treated animals. The results showed that electroporation using the SB system is a simple and affordable method for inducing long-term CAR expression in T lymphocytes. Expansion of gene-modified T cells with the lymphoblastoid cell line provided up to 2 cycles of stimulations, generating effective T cells against leukemia in vitro and in vivo.