Abstract The phytohormone auxin controls many processes in plants, at least in part through its regulation of cell expansion 1 . The acid growth hypothesis has been proposed to explain auxin-stimulated cell expansion for five decades, but the mechanism that underlies auxin-induced cell-wall acidification is poorly characterized. Auxin induces the phosphorylation and activation of the plasma membrane H + -ATPase that pumps protons into the apoplast 2 , yet how auxin activates its phosphorylation remains unclear. Here we show that the transmembrane kinase (TMK) auxin-signalling proteins interact with plasma membrane H + -ATPases, inducing their phosphorylation, and thereby promoting cell-wall acidification and hypocotyl cell elongation in Arabidopsis . Auxin induced interactions between TMKs and H + -ATPases in the plasma membrane within seconds, as well as TMK-dependent phosphorylation of the penultimate threonine residue on the H+-ATPases. Our genetic, biochemical and molecular evidence demonstrates that TMKs directly phosphorylate plasma membrane H + -ATPase and are required for auxin-induced H + -ATPase activation, apoplastic acidification and cell expansion. Thus, our findings reveal a crucial connection between auxin and plasma membrane H + -ATPase activation in regulating apoplastic pH changes and cell expansion through TMK-based cell surface auxin signalling.

The oil from flax (Linum usitatissimum L.) has high amounts of α-linolenic acid (ALA; 18:3cisΔ9,12,15) and is one of the richest sources of omega-3 polyunsaturated fatty acids (ω-3-PUFAs). To produce ∼57% ALA in triacylglycerol (TAG), it is likely that flax contains enzymes that can efficiently transfer ALA to TAG. To test this hypothesis, we conducted a systematic characterization of TAG-synthesizing enzymes from flax. We identified several genes encoding acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferases (DGATs) and phospholipid:diacylglycerol acyltransferases (PDATs) from the flax genome database. Due to recent genome duplication, duplicated gene pairs have been identified for all genes except DGAT2-2. Analysis of gene expression indicated that two DGAT1, two DGAT2, and four PDAT genes were preferentially expressed in flax embryos. Yeast functional analysis showed that DGAT1, DGAT2, and two PDAT enzymes restored TAG synthesis when produced recombinantly in yeast H1246 strain. The activity of particular PDAT enzymes (LuPDAT1 and LuPDAT2) was stimulated by the presence of ALA. Further seed-specific expression of flax genes in Arabidopsis thaliana indicated that DGAT1, PDAT1, and PDAT2 had significant effects on seed oil phenotype. Overall, this study indicated the existence of unique PDAT enzymes from flax that are able to preferentially catalyze the synthesis of TAG containing ALA acyl moieties. The identified LuPDATs may have practical applications for increasing the accumulation of ALA and other polyunsaturated fatty acids in oilseeds for food and industrial applications.Background: Triacylglycerol (TAG) can be formed via an acyl-CoA-dependent or acyl-CoA-independent pathway.Results: Overexpressing particular flax phospholipid:diacylglycerol acyltransferase (PDAT) genes in yeast and Arabidopsis resulted in an enhanced proportion of α-linolenic acid (ALA) in TAG.Conclusion: Certain PDATs have the unique ability to efficiently channel ALA into TAG.Significance: The identified PDATs will benefit future projects aimed at producing oils with enhanced polyunsaturated fatty acid content. The oil from flax (Linum usitatissimum L.) has high amounts of α-linolenic acid (ALA; 18:3cisΔ9,12,15) and is one of the richest sources of omega-3 polyunsaturated fatty acids (ω-3-PUFAs). To produce ∼57% ALA in triacylglycerol (TAG), it is likely that flax contains enzymes that can efficiently transfer ALA to TAG. To test this hypothesis, we conducted a systematic characterization of TAG-synthesizing enzymes from flax. We identified several genes encoding acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferases (DGATs) and phospholipid:diacylglycerol acyltransferases (PDATs) from the flax genome database. Due to recent genome duplication, duplicated gene pairs have been identified for all genes except DGAT2-2. Analysis of gene expression indicated that two DGAT1, two DGAT2, and four PDAT genes were preferentially expressed in flax embryos. Yeast functional analysis showed that DGAT1, DGAT2, and two PDAT enzymes restored TAG synthesis when produced recombinantly in yeast H1246 strain. The activity of particular PDAT enzymes (LuPDAT1 and LuPDAT2) was stimulated by the presence of ALA. Further seed-specific expression of flax genes in Arabidopsis thaliana indicated that DGAT1, PDAT1, and PDAT2 had significant effects on seed oil phenotype. Overall, this study indicated the existence of unique PDAT enzymes from flax that are able to preferentially catalyze the synthesis of TAG containing ALA acyl moieties. The identified LuPDATs may have practical applications for increasing the accumulation of ALA and other polyunsaturated fatty acids in oilseeds for food and industrial applications. Background: Triacylglycerol (TAG) can be formed via an acyl-CoA-dependent or acyl-CoA-independent pathway. Results: Overexpressing particular flax phospholipid:diacylglycerol acyltransferase (PDAT) genes in yeast and Arabidopsis resulted in an enhanced proportion of α-linolenic acid (ALA) in TAG. Conclusion: Certain PDATs have the unique ability to efficiently channel ALA into TAG. Significance: The identified PDATs will benefit future projects aimed at producing oils with enhanced polyunsaturated fatty acid content.

Sensing and signaling of cell wall status and dynamics regulate many processes in plants, such as cell growth and morphogenesis, but the underpinning mechanisms remain largely unknown. Here, we demonstrate that the CrRLK1L receptor kinase FERONIA (FER) binds the cell wall pectin, directly leading to the activation of the ROP6 guanosine triphosphatase (GTPase) signaling pathway that regulates the formation of the puzzle piece shape of pavement cells in Arabidopsis. The extracellular malectin domain of FER binds demethylesterified pectin in vivo and in vitro. Both loss-of-FER mutations and defects in pectin demethylesterification caused similar changes in pavement cell shape and ROP6 GTPase signaling. FER is required for the activation of ROP6 by demethylesterified pectin and physically and genetically interacts with the ROP6 activator, RopGEF14. Thus, our findings elucidate a signaling pathway that directly connects the cell wall pectin to cellular morphogenesis via the cell surface receptor FER.

Abstract Cell polarity is fundamental to the development of both eukaryotes and prokaryotes, yet the mechanisms behind its formation are not well understood. Here we found that, phytohormone auxin-induced, sterol-dependent nanoclustering of cell surface transmembrane receptor kinase 1 (TMK1) is critical for the formation of polarized domains at the plasma membrane (PM) during the morphogenesis of cotyledon pavement cells (PC) in Arabidopsis . Auxin-induced TMK1 nanoclustering stabilizes flotillin1-associated ordered nanodomains, which in turn promote the nanoclustering of ROP6 GTPase that acts downstream of TMK1 to regulate cortical microtubule organization. In turn, cortical microtubules further stabilize TMK1- and flotillin1-containing nanoclusters at the PM. Hence, we propose a new paradigm for polarity formation: A diffusive signal triggers cell polarization by promoting cell surface receptor-mediated nanoclustering of signaling components and cytoskeleton-mediated positive feedback that reinforces these nanodomains into polarized domains.

Vegetable oils are an extremely important agricultural commodity. Their use has risen inexorably for the last 50 years and will undoubtedly be even more prevalent in the future. They have a role not only in foodstuffs but also as renewable chemicals. However, our understanding of their metabolism, and particularly its control, is incomplete. In this article we highlight current knowledge and its deficiencies. In particular, we focus on the important role that phosphatidylcholine plays in lipid accumulation and in influencing the quality of the vegetable oils produced.

Abstract PHOSPHOLIPID:DIACYLGLYCEROL ACYLTRANSFERASE (PDAT) is an enzyme that catalyzes the transfer of a fatty acyl moiety from the sn-2 position of a phospholipid to the sn-3-position of sn-1,2-diacylglyerol, thus forming triacylglycerol and a lysophospholipid. Although the importance of PDAT in triacylglycerol biosynthesis has been illustrated in some previous studies, the evolutionary relationship of plant PDATs has not been studied in detail. In this study, we investigated the evolutionary relationship of the PDAT gene family across the green plants using a comparative phylogenetic framework. We found that the PDAT candidate genes are present in all examined green plants, including algae, lowland plants (a moss and a lycophyte), monocots, and eudicots. Phylogenetic analysis revealed the evolutionary division of the PDAT gene family into seven major clades. The separation is supported by the conservation and variation in the gene structure, protein properties, motif patterns, and/or selection constraints. We further demonstrated that there is a eudicot-wide PDAT gene expansion, which appears to have been mainly caused by the eudicot-shared ancient gene duplication and subsequent species-specific segmental duplications. In addition, selection pressure analyses showed that different selection constraints have acted on three core eudicot clades, which might enable paleoduplicated PDAT paralogs to either become nonfunctionalized or develop divergent expression patterns during evolution. Overall, our study provides important insights into the evolution of the plant PDAT gene family and explores the evolutionary mechanism underlying the functional diversification among the core eudicot PDAT paralogs.

Auxin is well known to control pattern formation and directional growth at the organ/tissue levels via the nuclear TIR1/AFB receptor-mediated transcriptional responses. Recent studies have expanded the arena of auxin actions as a trigger or key regulator of cell polarization and morphogenesis. These actions require non-transcriptional responses such as changes in the cytoskeleton and vesicular trafficking, which are commonly regulated by ROP/Rac GTPase-dependent pathways. These findings beg for the question about the nature of auxin receptors that regulate these responses and renew the interest in ABP1 as a cell surface auxin receptor, including the work showing auxin-binding protein 1 (ABP1) interacts with the extracellular domain of the transmembrane kinase (TMK) receptor-like kinases in an auxin-dependent manner, as well as the debate on this auxin binding protein discovered about 40 years ago. This review highlights recent work on the non-transcriptional auxin signaling mechanisms underscoring cell polarity and shape formation in plants.

Seed oil from flax (Linum usitatissimum) is enriched in α-linolenic acid (ALA; 18:3Δ9cis,12cis,15cis), but the biochemical processes underlying the enrichment of flax seed oil with this polyunsaturated fatty acid are not fully elucidated. Here, a potential process involving the catalytic actions of long-chain acyl-CoA synthetase (LACS) and diacylglycerol acyltransferase (DGAT) is proposed for ALA enrichment in triacylglycerol (TAG). LACS catalyzes the ATP-dependent activation of free fatty acid to form acyl-CoA, which in turn may serve as an acyl-donor in the DGAT-catalyzed reaction leading to TAG. To test this hypothesis, flax LACS and DGAT cDNAs were functionally expressed in Saccharomyces cerevisiae strains to probe their possible involvement in the enrichment of TAG with ALA. Among the identified flax LACSs, LuLACS8A exhibited significantly enhanced specificity for ALA over oleic acid (18:1Δ9cis) or linoleic acid (18:2Δ9cis,12cis). Enhanced α-linolenoyl-CoA specificity was also observed in the enzymatic assay of flax DGAT2 (LuDGAT2-3), which displayed ∼20 times increased preference toward α-linolenoyl-CoA over oleoyl-CoA. Moreover, when LuLACS8A and LuDGAT2-3 were co-expressed in yeast, both in vitro and in vivo experiments indicated that the ALA-containing TAG enrichment process was operative between LuLACS8A- and LuDGAT2-3-catalyzed reactions. Overall, the results support the hypothesis that the cooperation between the reactions catalyzed by LACS8 and DGAT2 may represent a route to enrich ALA production in the flax seed oil.

Seed oils of flax (Linum usitatissimum L.) and many other plant species contain substantial amounts of polyunsaturated fatty acids (PUFAs). Phosphatidylcholine (PC) is the major site for PUFA synthesis. The exact mechanisms of how these PUFAs are channeled from PC into triacylglycerol (TAG) needs to be further explored. By using in vivo and in vitro approaches, we demonstrated that the PC deacylation reaction catalyzed by the reverse action of acyl-CoA:lysophosphatidylcholine acyltransferase (LPCAT) can transfer PUFAs on PC directly into the acyl-CoA pool, making these PUFAs available for the diacylglycerol acyltransferase (DGAT)-catalyzed reaction for TAG production. Two types of yeast mutants were generated for in vivo and in vitro experiments, respectively. Both mutants provide a null background with no endogenous TAG forming capacity and an extremely low LPCAT activity. In vivo experiments showed that co-expressing flax DGAT1-1 and LPCAT1 in the yeast quintuple mutant significantly increased 18-carbon PUFAs in TAG with a concomitant decrease of 18-carbon PUFAs in phospholipid. We further showed that after incubation of sn-2-[¹⁴C]acyl-PC, formation of [¹⁴C]TAG was only possible with yeast microsomes containing both LPCAT1 and DGAT1-1. Moreover, the specific activity of overall LPCAT1 and DGAT1-1 coupling process exhibited a preference for transferring ¹⁴C-labeled linoleoyl or linolenoyl than oleoyl moieties from the sn-2 position of PC to TAG. Together, our data support the hypothesis of biochemical coupling of the LPCAT1-catalyzed reverse reaction with the DGAT1-1-catalyzed reaction for incorporating PUFAs into TAG. This process represents a potential route for enriching TAG in PUFA content during seed development in flax.

Flax (Linum usitatissimum L.) is an agriculturally important crop with seed oil enriched in α-linolenic acid (18:3 cisΔ9, 12, 15; ALA). This polyunsaturated fatty acid (PUFA) is the major determinant for the quality of flax seed oil in food, nutraceuticals and industrial applications. The recently identified enzyme: phosphatidylcholine diacylglycerol cholinephosphotransferase (PDCT), catalyzes the interconversion between phosphatidylcholine (PC) and diacylglycerol (DAG), and has been shown to play an important role in PUFA accumulation in Arabidopsis thaliana seeds. Two flax PDCT genes were identified using homology-based approach. In this study, we describe the isolation and characterization of two PDCT genes from flax (LuPDCT1 and LuPDCT2) with very high nucleotide sequence identity (97%) whose deduced amino acid sequences exhibited approximately 55% identity with that of A. thaliana PDCT (AtROD1). The genes encoded functionally active enzymes that were strongly expressed in developing embryos. Complementation studies with the A. thaliana rod1 mutant demonstrated that the flax PDCTs were capable of restoring PUFA levels in planta. Furthermore, PUFA levels increased in Saccharomyces cerevisiae when the flax PDCTs were co-expressed with FATTY ACID DESATURASES (FADs), FAD2 and FAD3, while seed-specific expression of LuPDCT1 and LuPDCT2 in A. thaliana resulted in 16.4% and 19.7% increases in C18-PUFAs, respectively, with a concomitant decrease in the proportion of oleic acid (18:1 cisΔ9; OA). The two novel PDCT homologs from flax are capable of increasing C18-PUFA levels substantially in metabolically engineered yeast and transgenic A. thaliana seeds. These flax PDCT proteins appear to play an important dual role in the determination of PUFA content by efficiently channelling monounsaturated FAs into PC for desaturation and moving the resulting PUFAs out of PC for subsequent use in TAG synthesis. These results indicate that flax PDCTs would be useful for bioengineering of oil crops to increase PUFA levels for applications in human food and nutritional supplements, animal feed and industrial bioproducts.