Despite its limited analytical specificity and ruggedness, the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay has been widely used as a generic metric of lipid peroxidation in biological fluids. It is often considered a good indicator of the levels of oxidative stress within a biological sample, provided that the sample has been properly handled and stored. The assay involves the reaction of lipid peroxidation products, primarily malondialdehyde (MDA), with thiobarbituric acid (TBA), which leads to the formation of MDA-TBA2 adducts called TBARS. TBARS yields a red-pink color that can be measured spectrophotometrically at 532 nm. The TBARS assay is performed under acidic conditions (pH = 4) and at 95 °C. Pure MDA is unstable, but these conditions allow the release of MDA from MDA bis(dimethyl acetal), which is used as the analytical standard in this method. The TBARS assay is a straightforward method that can be completed in about 2 h. Preparation of assay reagents are described in detail here. Budget-conscious researchers can use these reagents for multiple experiments at a low cost rather than buying an expensive TBARS assay kit that only permits construction of a single standard curve (and thus can only be used for one experiment). The applicability of this TBARS assay is shown in human serum, low density lipoproteins, and cell lysates. The assay is consistent and reproducible, and limits of detection of 1.1 μM can be reached. Recommendations for the use and interpretation of the spectrophotometric TBARS assay are provided.

Despite its limited analytical specificity and ruggedness, the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay has been widely used as a generic metric of lipid peroxidation in biological fluids. It is often considered a good indicator of the levels of oxidative stress within a biological sample, provided that the sample has been properly handled and stored. The assay involves the reaction of lipid peroxidation products, primarily malondialdehyde (MDA), with thiobarbituric acid (TBA), which leads to the formation of MDA-TBA2 adducts called TBARS. TBARS yields a red-pink color that can be measured spectrophotometrically at 532 nm. The TBARS assay is performed under acidic conditions (pH = 4) and at 95 °C. Pure MDA is unstable, but these conditions allow the release of MDA from MDA bis(dimethyl acetal), which is used as the analytical standard in this method. The TBARS assay is a straightforward method that can be completed in about 2 h. Preparation of assay reagents are described in detail here. Budget-conscious researchers can use these reagents for multiple experiments at a low cost rather than buying an expensive TBARS assay kit that only permits construction of a single standard curve (and thus can only be used for one experiment). The applicability of this TBARS assay is shown in human serum, low density lipoproteins, and cell lysates. The assay is consistent and reproducible, and limits of detection of 1.1 μM can be reached. Recommendations for the use and interpretation of the spectrophotometric TBARS assay are provided.

Blood plasma is a readily accessible source of extracellular vesicles (EVs), i.e., cell-secreted nanosized carriers that contain various biomolecules, including glycans. Previous studies have demonstrated that glycans play a major role in physiological and pathological processes, and certain plasma glycans have been associated with disease conditions. However, glycome studies have been limited by a lack of analytical techniques with the throughput capacity necessary to study hundreds of clinical samples. This study is the first to characterize the EV plasma glycome based on all major glycan classes. The results based on glycan node analysis revealed, as expected, that plasma-derived EVs have distinct glycan features from donor-matched whole plasma. Specifically, glycan nodes corresponding to those observed in chondroitin sulfate, dermatan sulfate, type I keratan sulfate, and type II keratan sulfate were enriched on EVs. The identification of specific differences in glycan features in plasma vs. plasma-derived EVs is relevant for understanding the physiological role of EVs and as a reference for future diagnostic studies. Additionally, the results indicate that EV glycan nodes do not substantially differ among a small set of healthy donors. These results lay the framework for the further evaluation of all EV glycan classes as diagnostic markers, therapeutic targets, and biologically active components in health and disease.

Lung cancer is the leading cause of cancer death in women living in the United States, which accounts for approximately the same percentage of cancer deaths in women as breast, ovary, and uterine cancers combined. Targeted blood plasma glycomics represents a promising source of noninvasive diagnostic and prognostic biomarkers for lung cancer. Here, 208 samples from lung cancer patients and 207 age-matched controls enrolled in the Women Epidemiology Lung Cancer (WELCA) study were analyzed by a bottom-up glycan "node" analysis approach. Glycan features, quantified as single analytical signals, including 2-linked mannose, α2-6 sialylation, β1-4 branching, β1-6 branching, 4-linked GlcNAc, and antennary fucosylation, exhibited abilities to distinguish cases from controls (ROC AUCs: 0.68-0.92) and predict survival in patients (hazard ratios: 1.99-2.75) at all stages. Notable alterations of glycan features were observed in stages I-II. Diagnostic and prognostic glycan features were mostly independent of smoking status, age, gender, and histological subtypes of lung cancer.

Elevated concentrations of circulating low density lipoprotein (LDL) that is abnormally oxidized and desialylated is both a precursor to and a hallmark of atherosclerosis. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) treated in vitro with interleukin-2 (IL-2) become lymphokine activated killer (LAK) cells, the primary effectors of which are NK cells and NKT cells. LAK cells display antitumor functions such as increased cytotoxicity and IFN-γ production, and they have been evaluated as a potential cancer therapeutic. Atherosclerotic processes may influence innate immunity against cancer. Because prior studies have shown that low density lipoprotein (LDL) reduces T-cell and NK cell antitumor functions, we asked whether oxidized-desialylated LDL affects the functionality of LAK cells in vitro. We show here that LAK cells take up oxidized-desialylated LDL to a significantly greater extent than native LDL over a period of 72 hours. This resulted in a significant downregulation of LAK cell cytotoxicity against K562 cells. In particular, the expression of IFN-γ, CD56, and NKG2D were reduced upon oxidized-desialylated LDL treatment of LAK cells and, conversely, their expression was enhanced with native LDL. It was also observed that as the number of CD56 and NKG2D positive cells decreased upon treatment with oxidized-desialylated LDL, the number of CD3 positive cells increased in proportion. Additionally, only a slight inhibition of LAK cell cytotoxicity was observed with desialylation alone of LDL, and no significant inhibition was observed with oxidation alone of LDL. Thus, this study describes a new role of oxidized-desialylated LDL as an inhibitor of the antitumor functions of LAK cells. These observations have implications for how atherosclerosis processes, namely oxidation and desialylation of LDL, may influence LAK cell antitumor activity.

Abstract Factors regulating macrophage effector function represent potential targets to optimize the efficacy of antibody-mediated therapies. Macrophages are myeloid cells capable of engulfing and destroying diseased or damaged target cells. Antibodies binding to the target cell surface can engage macrophage Fc gamma receptors (FcγRs) to elicit antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), a process that contributes to treatments mediated by anti-tumor antibodies. Conversely, macrophage ADCP of apoptotic T cells is also linked to tolerance in the tumor environment. Here we evaluated the role of asparagine(N)-linked glycans in the function of macrophages derived from primary human monocytes. Macrophages treated with kifunensine, an inhibitor of N-glycan processing, exhibited greater target binding and ADCP of antibody-coated target cells. Kifunensine treatment increased ADCP of both rituximab-coated Raji B cells and trastuzumab-coated SKBR3 cells. ADCP required FcγRs; inhibiting CD64 / FcγRI led to the greatest reduction, followed by CD32 / FcγRII and then CD16 / FcγRIII in most donors. Kifunensine treatment also increased the antibody-binding affinity of CD16. Differences in the abundance of phosphorylated immune receptors, including Siglec-9, CD32a, and LAIR-1 correlated with the increased ADCP. These results demonstrate that N-glycan processing regulates macrophage effector function.

The antibody-binding Fc γ receptors (FcγRs) trigger life-saving immune responses and many therapeutic monoclonal antibodies require FcγR engagement for full effect. One proven strategy to improve the efficacy of antibody therapies is to increase receptor binding affinity, in particular binding to FcγRIIIa/CD16a. Currently, affinities are measured using recombinantly-expressed soluble extracellular FcγR domains and CD16a-mediated antibody-dependent immune responses are characterized using cultured cells. It is notable that CD16a is highly processed with multiple N-glycosylation sites, and preventing individual N-glycan modifications affects affinity. Furthermore, multiple groups have demonstrated that CD16a N-glycan composition is variable and composition impacts antibody binding affinity. The level of N-glycosylation at each site is not known though computational prediction indicates low to moderate potential at each site based on primary sequence (40-70%). Here we quantify occupancy of the extracellular domains using complementary mass spectrometry-based methods. All five sites of the tighter-binding CD16a V158 allotype showed 65-100% N-glycan occupancy in proteomics-based experiments. These observations were confirmed using intact protein mass spectrometry that demonstrated the predominant species corresponded to CD16a V158 with five N-glycans, with a smaller contribution from CD16a with four N-glycans. Occupancy was likewise high for the membrane-bound receptor at all detected N-glycosylation sites using CD16a purified from cultured human natural killer cells. Occupancy of the N162 site, critical for antibody binding, appeared independent of N169 occupancy based on analysis of the T171A mutant protein. The weaker-binding CD16a F158 allotype showed higher occupancy of >93% at each site.

Glycan "node" analysis is the process by which pooled glycans within complex biological samples are chemically deconstructed in a way that facilitates the analytical quantification of uniquely linked monosaccharide units (glycan "nodes"). It is based on glycan methylation analysis (a.k.a. linkage analysis) that has historically been applied to pre-isolated glycans. Thus, when using glycan node analysis, unique glycan features within whole biospecimens such as "core fucosylation," "α2-6 sialylation," "β1-6 branching," "β1-4 branching," and "bisecting GlcNAc," are captured as single analytical signals by GC-MS. Here we describe the use of this methodology in cell culture supernatant and in the analysis of IgG (alpha-1 antitrypsin) glycans. The effect of IL-6 and IL-1β cytokines on secreted hepatocyte protein glycan features is demonstrated; likewise, the impact of neuraminidase treatment of IgG is illustrated. For the majority of glycan nodes, the assay is consistent and reproducible on a day-to-day basis; because of this, relatively subtle shifts in the relative abundance of glycan features can be captured using this approach.