Sequencing the RNA in a biological sample can unlock a wealth of information, including the identity of bacteria and viruses, the nuances of alternative splicing or the transcriptional state of organisms. However, current methods have limitations due to short read lengths and reverse transcription or amplification biases. Here we demonstrate nanopore direct RNA-seq, a highly parallel, real-time, single-molecule method that circumvents reverse transcription or amplification steps. This method yields full-length, strand-specific RNA sequences and enables the direct detection of nucleotide analogs in RNA.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a smoking-related illness affecting 64 million people worldwide. Airway infection drives recurrent exacerbations and lung function decline. Prophylactic antibiotics may prevent exacerbations but their use is a significant cause of population antimicrobial resistance. We characterised the sputum microbiome by 16S rRNA gene analysis using 138 samples collected during a randomised controlled trial of prophylactic antibiotics in 71 patients with stable COPD. On comparing the profile of the microbiome obtained by sequencing to the isolates grown from samples using standard culture, there were similarities overall, although with a much narrower spectrum of genera on culture with under-representation of certain genera including Veillonella and Prevotella. There was concordance in the most abundant genera within samples and the number of isolates cultured reflected the measured bacterial diversity. We found that at baseline the microbiota of 17 (24%) patients were dominated by Haemophilus influenzae, accompanied by narrowed microbial diversity and higher levels of sputum inflammatory cytokines. Different H. influenzae strains co-existed within individuals. Opportunistic whole genome sequencing of six H. influenzae isolates obtained during the study revealed that all were non-typeable H. influenzae (NTHI), with a range of different antibiotic resistance gene profiles, but an identical complement of virulence genes. Administration of 13 weeks prophylaxis with moxifloxacin, azithromycin or doxycycline revealed distinctive changes in microbial communities for each group. Haemophilus numbers reduced by 90% compared to placebo only after moxifloxacin, and significant reduction in sputum cytokines occurred in patients dominated by Haemophilus at baseline. Haemophilus influenzae dominance defines COPD patients with active disease who may particularly benefit from antibiotics or vaccination.

Background Normal airway microbial communities play a central role in respiratory health but are poorly characterized. Cigarette smoking is the dominant global environmental influence on lung function, and asthma has become the most prevalent chronic respiratory disease worldwide. Both conditions have major microbial components that are also poorly defined.Methods We investigated airway bacterial communities in a general population sample of 529 Australian adults. Posterior oropharyngeal swabs were analysed by sequencing of the 16S rRNA and methionine aminopeptidase genes. The microbiota were characterised according to their prevalence, abundance, and network memberships.Findings Microbial communities were similar across the population and were strongly organized into co-abundance networks. Smoking associated with diversity loss, negative effects on abundant taxa, profound alterations to network structure and expansion of Streptococcus spp. By contrast, the asthmatic microbiota were selectively affected by an increase in Neisseria spp. and by reduced numbers of low abundance but prevalent organisms.Interpretation Our study shows healthy airway microbiota are contained within a highly structured ecosystem, indicating balanced relationships between the microbiome and human host factors. The marked abnormalities in smokers may be pathogenic for chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and lung cancer. The narrow spectrum of abnormalities in asthmatics encourages investigation of damaging and protective effects of specific bacteria.Funding The study was funded by the Asmarley Trust and a Wellcome Senior Investigator Award to WOCC and MFM (P46009). The Busselton Healthy Ageing Study is supported by the Government of Western Australia (Office of Science, Department of Health) the City of Busselton, and private donations.

Abstract Genome sequencing has been widely deployed to study the evolution of SARS-CoV-2 with more than 90,000 genome sequences uploaded to the GISAID database. We published a method for SARS-CoV-2 genome sequencing ( https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-bbmuik6w ) online on January 22, 2020. This approach has rapidly become the most popular method for sequencing SARS-CoV-2 due to its simplicity and cost-effectiveness. Here we present improvements to the original protocol: i) an updated primer scheme with 22 additional primers to improve genome coverage, ii) a streamlined library preparation workflow which improves demultiplexing rate for up to 96 samples and reduces hands-on time by several hours and iii) cost savings which bring the reagent cost down to £10 per sample making it practical for individual labs to sequence thousands of SARS-CoV-2 genomes to support national and international genomic epidemiology efforts.

Oxford Nanopore (ONT) is a leading long-read technology which has been revolutionizing transcriptome analysis through its capacity to sequence the majority of transcripts from end-to-end. This has greatly increased our ability to study the diversity of transcription mechanisms such as transcription initiation, termination, and alternative splicing. However, ONT still suffers from high error rates which have thus far limited it scope to reference-based analyses. When a reference is not available or is not a viable option due to reference-bias, error correction is a crucial step towards the reconstruction of the sequenced transcripts and downstream sequence analysis of transcripts. In this paper, we present a novel computational method to error-correct ONT cDNA sequencing data, called isONcorrect. IsONcorrect is able to jointly use all isoforms from a gene during error correction, thereby allowing it to correct reads at low sequencing depths. We are able to obtain an accuracy of 98.7-99.5%, demonstrating the feasibility of applying cost-effective cDNA full transcript length sequencing for reference-free transcriptome analysis.