Efficient and precise genome editing requires a fast, quantitative, and inexpensive assay to assess genotype following editing. Here, we present ICE (Inference of CRISPR Edits), which enables robust analysis of CRISPR edits using Sanger data. ICE proposes potential outcomes for editing with guide RNAs, and then determines which are supported by the data via regression. The ICE algorithm is robust and reproducible, and it can be used to analyze CRISPR experiments within days after transfection. We also confirm that ICE produces accurate estimates of editing outcomes across a variety of benchmarks, and within the context of other existing Sanger analysis tools. The ICE tool is free to use and open source, and offers several improvements over current analysis tools, such as batch analysis and support for a variety of editing conditions. It is available online at ice.synthego.com, and the source code is available at github.com/synthego-open/ice.

Abstract The regulation of cell physiology largely depends upon intracellular interactions of functionally distinct proteins that act in combination. These interactions, which are often transient in nature, help to define the motion profiles of proteins. Measurement of protein motion within a living cellular environment will enable dissection of key interactions among proteins, however, attempts to measure protein motion are typically limited by the low spatial and temporal resolution of existing experimental platforms. Here, we describe a high-throughput single-molecule imaging platform that measures protein motion in living cells. We demonstrate the application of this platform by studying the dynamics of steroid hormone receptors and explore the pharmacology of compounds that affect estrogen receptor (ER) activity. Using our high-throughput single-molecule tracking (htSMT) platform, we screened 5,067 bioactive molecules, identifying multiple proteins and signaling pathways which perturb ER dynamics. We further deployed htSMT to characterize the impact of known ER modulators on ER protein dynamics, uncovering a correlation between ER dynamics and the ability of ER antagonists to suppress cancer cell growth. SMT provides a novel platform capable of measuring real-time target engagement within the living cellular environment. Our results support the view that this tool will prove uniquely valuable in measuring the dynamic interactions among proteins and will prove powerful for the identification of novel therapeutics.

Efficient precision genome editing requires a quick, quantitative, and inexpensive assay of editing outcomes. Here we present ICE (Inference of CRISPR Edits), which enables robust analysis of CRISPR edits using Sanger data. ICE proposes potential outcomes for editing with guide RNAs (gRNAs) and then determines which are supported by the data via regression. Additionally, we develop a score called ICE-D (Discordance) that can provide information on large or unexpected edits. We empirically confirm through over 1,800 edits that the ICE algorithm is robust, reproducible, and can analyze CRISPR experiments within days after transfection. We also confirm that ICE strongly correlates with next-generation sequencing of amplicons (Amp-Seq). The ICE tool is free to use and offers several improvements over current analysis tools. For instance, ICE can analyze individual experiments as well as multiple experiments simultaneously (batch analysis). ICE can also detect a wider variety of outcomes, including multi-guide edits (multiple gRNAs per target) and edits resulting from homology-directed repair (HDR), such as knock-ins and base edits. ICE is a reliable analysis tool that can significantly expedite CRISPR editing workflows. It is available online at [ice.synthego.com][1], and the source code is at [github.com/synthego-open/ice][2] [1]: http://ice.synthego.com [2]: http://github.com/synthego-open/ice

The regulation of cell physiology depends largely upon interactions of functionally distinct proteins and cellular components. These interactions may be transient or long-lived, but often affect protein motion. Measurement of protein dynamics within a cellular environment, particularly while perturbing protein function with small molecules, may enable dissection of key interactions and facilitate drug discovery; however, current approaches are limited by throughput with respect to data acquisition and analysis. As a result, studies using super-resolution imaging are typically drawing conclusions from tens of cells and a few experimental conditions tested. We addressed these limitations by developing a high-throughput single-molecule tracking (htSMT) platform for pharmacologic dissection of protein dynamics in living cells at an unprecedented scale (capable of imaging >10 6 cells/day and screening >10 4 compounds). We applied htSMT to measure the cellular dynamics of fluorescently tagged estrogen receptor (ER) and screened a diverse library to identify small molecules that perturbed ER function in real time. With this one experimental modality, we determined the potency, pathway selectivity, target engagement, and mechanism of action for identified hits. Kinetic htSMT experiments were capable of distinguishing between on-target and on-pathway modulators of ER signaling. Integrated pathway analysis recapitulated the network of known ER interaction partners and suggested potentially novel, kinase-mediated regulatory mechanisms. The sensitivity of htSMT revealed a new correlation between ER dynamics and the ability of ER antagonists to suppress cancer cell growth. Therefore, measuring protein motion at scale is a powerful method to investigate dynamic interactions among proteins and may facilitate the identification and characterization of novel therapeutics.