The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus enters host cells via an interaction between its Spike protein and the host cell receptor angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). By screening a yeast surface-displayed library of synthetic nanobody sequences, we developed nanobodies that disrupt the interaction between Spike and ACE2. Cryo-electron microscopy (cryo-EM) revealed that one nanobody, Nb6, binds Spike in a fully inactive conformation with its receptor binding domains locked into their inaccessible down state, incapable of binding ACE2. Affinity maturation and structure-guided design of multivalency yielded a trivalent nanobody, mNb6-tri, with femtomolar affinity for Spike and picomolar neutralization of SARS-CoV-2 infection. mNb6-tri retains function after aerosolization, lyophilization, and heat treatment, which enables aerosol-mediated delivery of this potent neutralizer directly to the airway epithelia.

The SARS-CoV-2 protein Nsp2 has been implicated in a wide range of viral processes, but its exact functions, and the structural basis of those functions, remain unknown. Here, we report an atomic model for full-length Nsp2 obtained by combining cryo-electron microscopy with deep learning-based structure prediction from AlphaFold2. The resulting structure reveals a highly-conserved zinc ion-binding site, suggesting a role for Nsp2 in RNA binding. Mapping emerging mutations from variants of SARS-CoV-2 on the resulting structure shows potential host-Nsp2 interaction regions. Using structural analysis together with affinity tagged purification mass spectrometry experiments, we identify Nsp2 mutants that are unable to interact with the actin-nucleation-promoting WASH protein complex or with GIGYF2, an inhibitor of translation initiation and modulator of ribosome-associated quality control. Our work suggests a potential role of Nsp2 in linking viral transcription within the viral replication-transcription complexes (RTC) to the translation initiation of the viral message. Collectively, the structure reported here, combined with mutant interaction mapping, provides a foundation for functional studies of this evolutionary conserved coronavirus protein and may assist future drug design.

Without an effective prophylactic solution, infections from SARS-CoV-2 continue to rise worldwide with devastating health and economic costs. SARS-CoV-2 gains entry into host cells via an interaction between its Spike protein and the host cell receptor angiotensin converting enzyme 2 (ACE2). Disruption of this interaction confers potent neutralization of viral entry, providing an avenue for vaccine design and for therapeutic antibodies. Here, we develop single-domain antibodies (nanobodies) that potently disrupt the interaction between the SARS-CoV-2 Spike and ACE2. By screening a yeast surface-displayed library of synthetic nanobody sequences, we identified a panel of nanobodies that bind to multiple epitopes on Spike and block ACE2 interaction via two distinct mechanisms. Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) revealed that one exceptionally stable nanobody, Nb6, binds Spike in a fully inactive conformation with its receptor binding domains (RBDs) locked into their inaccessible down-state, incapable of binding ACE2. Affinity maturation and structure-guided design of multivalency yielded a trivalent nanobody, mNb6-tri, with femtomolar affinity for SARS-CoV-2 Spike and picomolar neutralization of SARS-CoV-2 infection. mNb6-tri retains stability and function after aerosolization, lyophilization, and heat treatment. These properties may enable aerosol-mediated delivery of this potent neutralizer directly to the airway epithelia, promising to yield a widely deployable, patient-friendly prophylactic and/or early infection therapeutic agent to stem the worst pandemic in a century.

Abstract The Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) and HER3 form a potent pro-oncogenic heterocomplex upon binding of growth factor neuregulin-1β (NRG1β) 1–3 . The mechanism by which HER2 and HER3 interact remains unknown in the absence of any structures of the complex. We isolated the NRG1β-bound near full-length HER2/HER3 dimer and obtained a 2.9Å cryo-electron microscopy (cryo-EM) reconstruction of the extracellular domain module which reveals unexpected dynamics at the HER2/HER3 dimerization interface. We show that the dimerization arm of NRG1β-bound HER3 is unresolved likely because the apo HER2 monomer fails to undergo a ligand-induced conformational change needed to establish a HER3 dimerization arm binding pocket. In a second structure of an oncogenic extracellular domain mutant of HER2, S310F, we observe a compensatory interaction with the HER3 dimerization arm that stabilizes the dimerization interface. We show that both HER2/HER3 and HER2-S310F/HER3 retain the capacity to bind to the HER2-directed therapeutic antibody, trastuzumab, but the mutant complex does not bind to pertuzumab. Our 3.5Å structure of the HER2-S310F/HER3/NRG1β/trastuzumab Fragment antigen binding (Fab) complex shows that the receptor dimer undergoes a conformational change to accommodate trastuzumab. Thus, like oncogenic mutations, therapeutics exploit the intrinsic dynamics of the HER2/HER3 heterodimer. The unique features of a singly liganded HER2/HER3 heterodimer underscore the allosteric sensing of the ligand occupancy by the dimerization interface and explain why extracellular domains of HER2 do not homo-associate via canonical active dimer interface.

Abstract De novo designed receptor transmembrane domains (TMDs) present opportunities for precise control of cellular receptor functions. We developed a de novo design strategy for generating programmed membrane proteins (proMPs): single-pass α-helical TMDs that self-assemble through computationally defined and crystallographically validated interfaces. We used these proMPs to program specific oligomeric interactions into a chimeric antigen receptor (CAR) and found that both in vitro CAR T cell cytokine release and in vivo antitumor activity scaled linearly with the oligomeric state encoded by the receptor TMD, from monomers up to tetramers. All programmed CARs (proCARs) stimulated substantially lower T cell cytokine release relative to the commonly used CD28 TMD, which we show elevated cytokine release through lateral recruitment of the endogenous T cell costimulatory receptor CD28. Precise design using orthogonal and modular TMDs thus provides a new way to program receptor structure and predictably tune activity for basic or applied synthetic biology.

Human Epidermal growth factor Receptor 4 (HER4) carries out essential functions in the development and maintenance of the cardiovascular and nervous systems. HER4 activation is regulated by a diverse group of extracellular ligands including the neuregulin (NRG) family and betacellulin (BTC), which promote HER4 homodimerization or heterodimerization with other HER receptors. Important cardiovascular functions of HER4 are exerted via heterodimerization with its close homolog and orphan receptor, HER2. To date structural insights into ligand-mediated HER4 activation have been limited to crystallographic studies of HER4 ectodomain homodimers in complex with NRG1b. Here we report cryo-EM structures of near full-length HER2/HER4 heterodimers and full-length HER4 homodimers bound to NRG1b and BTC. We show that the structures of the heterodimers bound to either ligand are nearly identical and that in both cases the HER2/HER4 heterodimer interface is less dynamic than those observed in structures of HER2/EGFR and HER2/HER3 heterodimers. In contrast, structures of full-length HER4 homodimers bound to NRG1b and BTC display more large-scale dynamics mirroring states previously reported for EGFR homodimers. Our structures also reveal the presence of multiple glycan modifications within HER4 ectodomains, modeled for the first time in HER receptors, that distinctively contribute to the stabilization of HER4 homodimer interfaces over those of HER2/HER4 heterodimers.

Abstract De novo designed receptor transmembrane domains (TMDs) present opportunities for precise control of cellular functions. We develop a strategy for generating programmed membrane proteins (proMPs): single-pass α-helical TMDs that form oligomeric complexes through computationally defined and crystallographically validated interfaces. To demonstrate their usefulness, we program specific oligomeric interactions into a chimeric antigen receptor (to generate proCARs) and analyze the cytotoxic potency and cytokine release profiles of proCAR-T cells. We show that dimeric and trimeric proCAR-expressing T cells have significantly enhanced antitumor cytotoxicity compared to a monomeric proCAR and a reference CAR similar to those currently used in the clinic. Independently of oligomeric state, all proCAR-T cells exhibited strongly attenuated inflammatory cytokine release. These results have important implications for both safety and efficacy of cellular immunotherapies and highlight the advantages of programming precise structural features in engineered receptors through de novo protein design. The proMPs provide an exceptionally modular route to tuning receptor function and can be easily incorporated into existing CAR designs.

This study created a protein-protein interaction map of all the proteins present within the SARS-CoV-2 virus and humans. Understanding how viral proteins interact with human proteins gives researchers targets for the repurposing of drugs to treat COVID-19