Designer Anti-HIV Developing a protective HIV vaccine remains a top global health priority. One strategy to identify potential vaccine candidates is to isolate broadly neutralizing antibodies from infected individuals and then attempt to elicit the same antibody response through vaccination (see the Perspective by Burton and Weiss ). Wu et al. (p. 856 , published online 8 July) now report the identification of three broadly neutralizing antibodies, isolated from an HIV-1–infected individual, that exhibited great breadth and potency of neutralization and were specific for the co-receptor CD4-binding site of the glycoprotein 120 (gp120), part of the viral Env spike. Zhou et al. (p. 811 , published online 8 July) analyzed the crystal structure for one of these antibodies, VRC01, in complex with an HIV-1 gp120. VRC01 focuses its binding onto a conformationally invariant domain that is the site of initial CD4 attachment, which allows the antibody to overcome the glycan and conformational masking that diminishes the neutralization potency of most CD4-binding-site antibodies. The epitopes recognized by these antibodies suggest potential immunogens that can inform vaccine design.

Current human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) vaccines elicit strain-specific neutralizing antibodies. However, cross-reactive neutralizing antibodies arise in approximately 20% of HIV-1-infected individuals, and details of their generation could provide a blueprint for effective vaccination. Here we report the isolation, evolution and structure of a broadly neutralizing antibody from an African donor followed from the time of infection. The mature antibody, CH103, neutralized approximately 55% of HIV-1 isolates, and its co-crystal structure with the HIV-1 envelope protein gp120 revealed a new loop-based mechanism of CD4-binding-site recognition. Virus and antibody gene sequencing revealed concomitant virus evolution and antibody maturation. Notably, the unmutated common ancestor of the CH103 lineage avidly bound the transmitted/founder HIV-1 envelope glycoprotein, and evolution of antibody neutralization breadth was preceded by extensive viral diversification in and near the CH103 epitope. These data determine the viral and antibody evolution leading to induction of a lineage of HIV-1 broadly neutralizing antibodies, and provide insights into strategies to elicit similar antibodies by vaccination. Longitudinal sampling is used to map the evolution of an HIV-1 virus from the time of infection, and the co-evolution of a broadly neutralizing antibody in the same infected patient; the findings have important implications for HIV vaccine development. Hua-Xin Liao et al. followed the evolution of an HIV-1 virus, and the concurrent co-evolution of a CD4-binding-site broadly neutralizing antibody (BnAb), from the time of infection of a single African patient for a period of more than 3 years. The neutralizing antibody, of CH103 lineage, is a new type of BnAb that binds in a completely loop-based manner that differs from that of VRC01 class monoclonal antibodies — the CH103 lineage is less mutated, with fewer unusual macromutations and may be easier to induce. This work has implications for HIV vaccine development, suggesting viral strains that might generate broadly neutralizing antibodies within the host.

Cryo-electron microscopy is a popular method for the determination of protein structures; however, identifying a sufficient number of particles for analysis can take months of manual effort. Current computational approaches find many false positives and require ad hoc postprocessing, especially for unusually shaped particles. To address these shortcomings, we develop Topaz, an efficient and accurate particle-picking pipeline using neural networks trained with a general-purpose positive-unlabeled learning method. This framework enables particle detection models to be trained with few sparsely labeled particles and no labeled negatives. Topaz retrieves many more real particles than conventional picking methods while maintaining low false-positive rates, is capable of picking challenging unusually shaped proteins (for example, small, non-globular and asymmetric particles), produces more representative particle sets and does not require post hoc curation. We demonstrate the performance of Topaz on two difficult datasets and three conventional datasets. Topaz is modular, standalone, free and open source ( http://topaz.csail.mit.edu ). The challenge of accurate particle picking in cryo-EM analysis is addressed with Topaz, a neural-network-based algorithm that shows advantages over other tools, especially in picking unusually shaped particles.

Broadly neutralizing antibodies to HIV with similar specificities can be found in multiple HIV-infected individuals.

Adipocytes hold the body's major energy reserve as triacylglycerols packaged in large lipid droplets. Perilipins, the most abundant proteins on these lipid droplets, play a critical role in facilitating both triacylglycerol storage and hydrolysis. The stimulation of lipolysis by β-adrenergic agonists triggers rapid phosphorylation of perilipin and translocation of hormone-sensitive lipase to the surfaces of lipid droplets and more gradual fragmentation and dispersion of micro-lipid droplets. Because few lipid droplet-associated proteins have been identified in adipocytes, we isolated lipid droplets from basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes and identified the component proteins by mass spectrometry. Structural proteins identified in both preparations include perilipin, S3-12, vimentin, and TIP47; in contrast, adipophilin, caveolin-1, and tubulin selectively localized to droplets in lipolytically stimulated cells. Lipid metabolic enzymes identified in both preparations include hormone-sensitive lipase, lanosterol synthase, NAD(P)-dependent steroid dehydrogenase-like protein, acyl-CoA synthetase, long chain family member (ACSL) 1, and CGI-58. 17-β-Hydroxysteroid dehydrogenase, type 7, was identified only in basal preparations, whereas ACSL3 and 4 and two short-chain reductase/dehydrogenases were identified on droplets from lipolytically stimulated cells. Additionally, both preparations contained FSP27, ribophorin I, EHD2, diaphorase I, and ancient ubiquitous protein. Basal preparations contained CGI-49, whereas lipid droplets from lipolytically stimulated cells contained several Rab GTPases and tumor protein D54. A close association of mitochondria with lipid droplets was suggested by the identification of pyruvate carboxylase, prohibitin, and a subunit of ATP synthase in the preparations. Thus, adipocyte lipid droplets contain specific structural proteins as well as lipid metabolic enzymes; the structural reorganization of lipid droplets in response to the hormonal stimulation of lipolysis is accompanied by increases in the relative mass of several proteins and the recruitment of additional proteins. Adipocytes hold the body's major energy reserve as triacylglycerols packaged in large lipid droplets. Perilipins, the most abundant proteins on these lipid droplets, play a critical role in facilitating both triacylglycerol storage and hydrolysis. The stimulation of lipolysis by β-adrenergic agonists triggers rapid phosphorylation of perilipin and translocation of hormone-sensitive lipase to the surfaces of lipid droplets and more gradual fragmentation and dispersion of micro-lipid droplets. Because few lipid droplet-associated proteins have been identified in adipocytes, we isolated lipid droplets from basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes and identified the component proteins by mass spectrometry. Structural proteins identified in both preparations include perilipin, S3-12, vimentin, and TIP47; in contrast, adipophilin, caveolin-1, and tubulin selectively localized to droplets in lipolytically stimulated cells. Lipid metabolic enzymes identified in both preparations include hormone-sensitive lipase, lanosterol synthase, NAD(P)-dependent steroid dehydrogenase-like protein, acyl-CoA synthetase, long chain family member (ACSL) 1, and CGI-58. 17-β-Hydroxysteroid dehydrogenase, type 7, was identified only in basal preparations, whereas ACSL3 and 4 and two short-chain reductase/dehydrogenases were identified on droplets from lipolytically stimulated cells. Additionally, both preparations contained FSP27, ribophorin I, EHD2, diaphorase I, and ancient ubiquitous protein. Basal preparations contained CGI-49, whereas lipid droplets from lipolytically stimulated cells contained several Rab GTPases and tumor protein D54. A close association of mitochondria with lipid droplets was suggested by the identification of pyruvate carboxylase, prohibitin, and a subunit of ATP synthase in the preparations. Thus, adipocyte lipid droplets contain specific structural proteins as well as lipid metabolic enzymes; the structural reorganization of lipid droplets in response to the hormonal stimulation of lipolysis is accompanied by increases in the relative mass of several proteins and the recruitment of additional proteins. In vertebrate animals the most abundant energy reserve is stored as triacylglycerol in the lipid droplets of adipocytes. These lipid droplets can be as large as 100 μm and are composed of a core of triacylglycerol surrounded by a phospholipid and cholesterol monolayer into which numerous proteins are embedded. Most other types of cells contain tiny lipid droplets that store primarily cholesterol esters and serve as a reservoir of cholesterol for the synthesis and maintenance of membranes; steroidogenic cells of the adrenal cortex, testes, and ovaries use stored cholesterol additionally as a source of substrate for steroid hormone synthesis. Little is known about the mechanisms that control the flux of neutral lipids into and out of lipid droplets in any type of cell, but it is clear that the processes that control lipid traffic in adipocytes are central to the regulation of whole body energy metabolism. The first lipid droplet-associated proteins to be identified were members of the PAT family of proteins that includes perilipins, adipophilin (also called ADRP for adipose differentiation-related protein), TIP47, and S3-12; PAT family proteins are the major structural proteins of lipid droplets. Although adipophilin and TIP47 are ubiquitously expressed (1Brasaemle D.L. Barber T. Wolins N.E. Serrero G. Blanchette-Mackie E.J. Londos C. J. Lipid Res. 1997; 38: 2249-2263Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 2Heid H.W. Moll R. Schwetlick I. Rackwitz H.R. Keenan T.W. Cell Tissue Res. 1998; 294: 309-321Crossref PubMed Scopus (356) Google Scholar, 3Miura S. Gan J.W. Brzostowski J. Parisi M.J. Schultz C.J. Londos C. Oliver B. Kimmel A.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 32253-32257Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (304) Google Scholar, 4Than N.G. Sumegi B. Bellyei S. Berki T. Szekeres G. Janaky T. Szigeti A. Bohn H. Than G.N. Eur. J. Biochem. 2003; 270: 1176-1188Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar, 5Wolins N.E. Rubin B. Brasaemle D.L. J. Biol. Chem. 2001; 276: 5101-5108Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (242) Google Scholar), perilipins and S3-12 are selectively expressed in adipocytes from white and brown adipose tissue (6Greenberg A.S. Egan J.J. Wek S.A. Garty N.B. Blanchette-Mackie E.J. Londos C. J. Biol. Chem. 1991; 266: 11341-11346Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 7Wolins N.E. Skinner J.R. Schoenfish M.J. Tzekov A. Bensch K.G. Bickel P.E. J. Biol. Chem. 2003; 278: 37713-37721Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar) and steroidogenic cells (8Servetnick D.A. Brasaemle D.L. Gruia-Gray J. Kimmel A.R. Wolff J. Londos C. J. Biol. Chem. 1995; 270: 16970-16973Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (162) Google Scholar). Furthermore, perilipins, adipophilin, and S3-12 localize selectively to lipid droplets (1Brasaemle D.L. Barber T. Wolins N.E. Serrero G. Blanchette-Mackie E.J. Londos C. J. Lipid Res. 1997; 38: 2249-2263Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 6Greenberg A.S. Egan J.J. Wek S.A. Garty N.B. Blanchette-Mackie E.J. Londos C. J. Biol. Chem. 1991; 266: 11341-11346Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 7Wolins N.E. Skinner J.R. Schoenfish M.J. Tzekov A. Bensch K.G. Bickel P.E. J. Biol. Chem. 2003; 278: 37713-37721Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar, 9Blanchette-Mackie E.J. Dwyer N.K. Barber T. Coxey R.A. Takeda T. Rondinone C.M. Theodorakis J.L. Greenberg A.S. Londos C. J. Lipid Res. 1995; 36: 1211-1226Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), whereas TIP47 localizes to both cytosol and lipid droplets (3Miura S. Gan J.W. Brzostowski J. Parisi M.J. Schultz C.J. Londos C. Oliver B. Kimmel A.R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 32253-32257Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (304) Google Scholar, 4Than N.G. Sumegi B. Bellyei S. Berki T. Szekeres G. Janaky T. Szigeti A. Bohn H. Than G.N. Eur. J. Biochem. 2003; 270: 1176-1188Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar, 5Wolins N.E. Rubin B. Brasaemle D.L. J. Biol. Chem. 2001; 276: 5101-5108Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (242) Google Scholar) and, thus, differs from the other family members in being exchangeable between lipid-associated and soluble forms. Three protein isoforms of perilipin, perilipins A, B, and C, are translated from alternatively spliced forms of mRNA from a single gene; perilipin A is the most abundant protein on the lipid droplets of adipocytes. Studies in perilipin null mice (10Martinez-Botas J. Anderson J.B. Tessier D. Lapillonne A. Chang B.H. Quast M.J. Gorenstein D. Chen K.H. Chan L. Nat. Genet. 2000; 26: 474-479Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 11Tansey J.T. Sztalryd C. Gruia-Gray J. Roush D.L. Zee J.V. Gavrilova O. Reitman M.L. Deng C.X. Li C. Kimmel A.R. Londos C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 6494-6499Crossref PubMed Scopus (601) Google Scholar) and in various cultured cell models (12Brasaemle D.L. Rubin B. Harten I.A. Gruia-Gray J. Kimmel A.R. Londos C. J. Biol. Chem. 2000; 275: 38486-38493Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (364) Google Scholar, 13Garcia A. Subramanian V. Sekowski A. Bhattacharyya S. Love M.W. Brasaemle D.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 8409-8416Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (39) Google Scholar, 14Souza S.C. de Vargas L.M. Yamamoto M.T. Lien P. Franciosa M.D. Moss L.G. Greenberg A.S. J. Biol. Chem. 1998; 273: 24665-24669Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (247) Google Scholar, 15Souza S.C. Muliro K.V. Liscum L. Lien P. Yamamoto M.T. Schaffer J.E. Dallal G.E. Wang X. Kraemer F.B. Obin M. Greenberg A.S. J. Biol. Chem. 2002; 277: 8267-8272Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (197) Google Scholar, 16Sztalryd C. Xu G. Dorward H. Tansey J.T. Contreras J.A. Kimmel A.R. Londos C. J. Cell Biol. 2003; 161: 1093-1103Crossref PubMed Scopus (415) Google Scholar, 17Tansey J.T. Huml A.M. Vogt R. Davis K.E. Jones J.M. Fraser K.A. Brasaemle D.L. Kimmel A.R. Londos C. J. Biol. Chem. 2003; 278: 8401-8406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar, 18Zhang H.H. Souza S.C. Muliro K.V. Kraemer F.B. Obin M.S. Greenberg A.S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 51535-51542Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (110) Google Scholar) show that perilipins play an important role in regulating both the storage and hydrolysis of triacylglycerol in adipocytes. Under basal conditions, when the body is in the fed state, glucose and fatty acids are taken up by adipocytes and used to synthesize triacylglycerols; perilipin A facilitates the storage of triacylglycerols in lipid droplets by providing a barrier against lipolysis (10Martinez-Botas J. Anderson J.B. Tessier D. Lapillonne A. Chang B.H. Quast M.J. Gorenstein D. Chen K.H. Chan L. Nat. Genet. 2000; 26: 474-479Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 11Tansey J.T. Sztalryd C. Gruia-Gray J. Roush D.L. Zee J.V. Gavrilova O. Reitman M.L. Deng C.X. Li C. Kimmel A.R. Londos C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 6494-6499Crossref PubMed Scopus (601) Google Scholar, 12Brasaemle D.L. Rubin B. Harten I.A. Gruia-Gray J. Kimmel A.R. Londos C. J. Biol. Chem. 2000; 275: 38486-38493Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (364) Google Scholar). When energy is required, hormonal stimulation of β-adrenergic receptors on the plasma membranes of adipocytes triggers the phosphorylation of perilipin A by cAMP-dependent protein kinase, promoting lipolysis (15Souza S.C. Muliro K.V. Liscum L. Lien P. Yamamoto M.T. Schaffer J.E. Dallal G.E. Wang X. Kraemer F.B. Obin M. Greenberg A.S. J. Biol. Chem. 2002; 277: 8267-8272Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (197) Google Scholar, 16Sztalryd C. Xu G. Dorward H. Tansey J.T. Contreras J.A. Kimmel A.R. Londos C. J. Cell Biol. 2003; 161: 1093-1103Crossref PubMed Scopus (415) Google Scholar, 17Tansey J.T. Huml A.M. Vogt R. Davis K.E. Jones J.M. Fraser K.A. Brasaemle D.L. Kimmel A.R. Londos C. J. Biol. Chem. 2003; 278: 8401-8406Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar, 18Zhang H.H. Souza S.C. Muliro K.V. Kraemer F.B. Obin M.S. Greenberg A.S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 51535-51542Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (110) Google Scholar) at least in part by facilitating the docking of cAMP-dependent protein kinase-phosphorylated hormone-sensitive lipase on lipid droplets (16Sztalryd C. Xu G. Dorward H. Tansey J.T. Contreras J.A. Kimmel A.R. Londos C. J. Cell Biol. 2003; 161: 1093-1103Crossref PubMed Scopus (415) Google Scholar). Lipolytic stimulation of adipocytes initiates a complex program manifested by substantial morphological changes of the lipid droplets. The phosphorylation of perilipins and hormone-sensitive lipase occurs rapidly upon hormonal stimulation, and nearly quantitative translocation of hormone-sensitive lipase from the cytoplasm to the lipid droplet surface occurs in the first 5 min (19Brasaemle D.L. Levin D.M. Adler-Wailes D.C. Londos C. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1483: 251-262Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). Visible by 30 min and escalating over several hours, a dramatic fragmentation of lipid droplets occurs 1A. Marcinkiewicz, D. Gauthier, and D. L. Brasaemle, unpublished observations.1A. Marcinkiewicz, D. Gauthier, and D. L. Brasaemle, unpublished observations. (20Londos C. Brasaemle D.L. Schultz C.J. Adler-Wailes D.C. Levin D.M. Kimmel A.R. Rondinone C.M. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999; 892: 155-168Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar, 21Londos C. Brasaemle D.L. Schultz C.J. Segrest J.P. Kimmel A.R. Semin. Cell Dev. Biol. 1999; 10: 51-58Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar) that vastly increases the surface area and dispersion of the myriad micro-lipid droplets that are formed. Although initial studies have demonstrated these morphological changes in cultured 3T3-L1 adipocytes, recent evidence suggests that they also occur in lipolytically stimulated white adipose tissue in situ (22Granneman J.G. Li P. Lu Y. Tilak J. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2004; 287: E574-E582Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar). Thus, lipolytic stimulation of adipocytes triggers both rapid and more gradual but sustained changes in the protein content and morphology of lipid droplets. The protein composition of lipid droplets from yeast (23Athenstaedt K. Zweytick D. Jandrositz A. Kohlwein S.D. Daum G. J. Bacteriol. 1999; 181: 6441-6448Crossref PubMed Google Scholar, 24Zweytick D. Athenstaedt K. Daum G. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1469: 101-120Crossref PubMed Scopus (266) Google Scholar), Chinese hamster ovary fibroblasts (25Liu P. Ying Y. Zhao Y. Mundy D.I. Zhu M. Anderson R.G. J. Biol. Chem. 2004; 279: 3787-3792Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (435) Google Scholar), cultured human HuH7 hepatoma cells (26Fujimoto Y. Itabe H. Sakai J. Makita M. Noda J. Mori M. Higashi Y. Kojima S. Takano T. Biochim. Biophys. Acta. 2004; 1644: 47-59Crossref PubMed Scopus (275) Google Scholar), cultured human A431 epithelial cells (27Umlauf E. Csaszar E. Moertelmaier M. Schuetz G.J. Parton R.G. Prohaska R. J. Biol. Chem. 2004; 279: 23699-23709Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (206) Google Scholar), and mouse mammary glands (28Wu C.C. Howell K.E. Neville M.C. Yates III, J.R. McManaman J.L. Electrophoresis. 2000; 21: 3470-3482Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar) have been studied using techniques of proteomic analysis. These studies have revealed that lipid droplet-associated proteins include enzymes involved in many aspects of lipid metabolism; additionally, the mammalian lipid droplet preparations contained the ubiquitously expressed PAT family members adipophilin and TIP47. The protein composition of adipocyte lipid droplets has not yet been reported. Furthermore, unlike the other types of cells for which this information has been collected, the signaling mechanisms that stimulate lipolysis and the consequent remodeling of lipid droplets are unique to adipocytes. For these reasons we investigated the protein composition of lipid droplets isolated from cultured 3T3-L1 adipocytes incubated under both basal conditions that foster triacylglycerol storage and stimulated conditions when lipolysis is activated and fatty acids are released from the cells. To capture both rapid and more gradual changes to protein composition that might occur, we stimulated lipolysis for 2 h before the isolation of the lipid droplets. POROS 20 R2 beads were purchased from Applied Biosystems (Foster City, CA). C18 Zip-tips were from Millipore (Bedford, MA). Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride and trifluoroacetic acid were from Pierce. Ammonium bicarbonate, iodoacetamide, formic acid, insulin, isobutylmethylxanthine (IBMX), 2The abbreviations used are: IBMX, isobutylmethylxanthine; ACSL, acyl-CoA synthetase long chain family member; HPLC, high performance liquid chromatography; MS/MS, tandem mass spectrometry. dexamethasone, biotin, and heat-inactivated fetal bovine serum were from Sigma-Aldrich. Dulbecco's minimal essential medium, 100× penicillin and streptomycin solution, 200 mm glutamine stock for cell culture media, and HPLC grade acetonitrile and methanol were purchased from Fisher. Culture and Differentiation of 3T3-L1 Adipocytes—3T3-L1 preadipocytes (American Type Culture Collection, Herndon, VA) were cultured in 100-mm culture dishes from Corning-Costar as described previously (1Brasaemle D.L. Barber T. Wolins N.E. Serrero G. Blanchette-Mackie E.J. Londos C. J. Lipid Res. 1997; 38: 2249-2263Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar); confluent monolayers of 3T3-L1 cells, used within 6–10 passages, were induced to differentiate into adipocytes by the daily addition of Dulbecco's minimal essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 8 μg/ml biotin, 2 mm glutamine, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.5 mm IBMX, 10 μg/ml insulin, and 10 μm dexamethasone for 72 h followed by the daily addition of culture medium containing biotin but without insulin, IBMX, and dexamethasone for up to 3 more days. Incubation of 3T3-L1 Adipocytes in Lipolytically Stimulating Conditions and Isolation of Lipid Droplets—Six days after the initiation of differentiation, 40 dishes of 3T3-L1 adipocytes were incubated either with 10 μm isoproterenol and 0.5 mm IBMX for 2 h at 37 °C for lipolytically stimulated conditions or without the additions for basal conditions before harvest. Culture medium was removed, and cells were rinsed twice with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) before scraping cells into PBS using Sarstedt cell scrapers. Cells from sets of 10 dishes of cells were pooled into 15 ml conical screw-capped tubes (Falcon) and centrifuged at 500 x g for 5 min to pellet the cells. Cell pellets were resuspended in a hypotonic medium containing 10 mm Tris, pH 7.4, 1 mm EDTA, 10 mm sodium fluoride, 20 μg/ml leupeptin, 1 mm benzamidine, and 100 μm [4-(2-aminoethyl)benzenesulfonylfluoride] hydrochloride by pipetting and incubated on ice for 10 min before homogenization by 10 strokes in a Teflon-glass homogenizer. Cell lysates were centrifuged at 26,000 xg for 30 min at 4 °C in a SW41Ti rotor (Beckman), and the rotor was allowed to coast to a stop. The floating lipid droplet layers were harvested using a Beckman tube slicer, and the harvested fractions were adjusted to 25% sucrose and 100 mm sodium carbonate, pH 11.5, using a 60% sucrose stock solution and a 1 m sodium carbonate stock solution with protease inhibitors followed by gentle mixing by pipetting. The density-adjusted fractions (∼4 ml) were layered into centrifuge tubes containing 1-ml cushions of 60% sucrose and then overlaid with ∼5 ml of 100 mm sodium carbonate, pH 11.5, with protease inhibitors followed by ∼3.5 ml of the hypotonic lysis medium with protease inhibitors. Tubes were centrifuged at 26,000 × g for 30 min at 4 °C in a SW41Ti rotor, and the rotor was allowed to coast to a stop. Floating lipid droplets were harvested using a Beckman tube slicer into 1.5-ml microcentrifuge tubes. Residual carbonate solution was removed by centrifuging tubes at 14,000 × g for 20 min at 4 °C in an Eppendorf microcentrifuge; infranatant was removed with an 18-gauge needle from below the floating lipid droplet fraction, and the lipid droplet fraction was rinsed once with hypotonic lysis solution containing protease inhibitors. Delipidation of Lipid Droplets, Preparation of Component Proteins, and SDS-PAGE—Lipid droplet fractions in microcentrifuge tubes were delipidated with 1.5 ml of cold acetone overnight at –20 °C followed by centrifugation at 14,000 × g for 30 min at 4 °C and removal of solvent from the protein pellet. The pellet was further extracted with room temperature acetone followed by 1:1 acetone:ether (v:v) and ether. Residual solvents were evaporated under nitrogen, and proteins were solubilized in 2× Laemmli sample buffer (29Laemmli U.K. Nature. 1970; 227: 680-685Crossref PubMed Scopus (206660) Google Scholar) by incubation in a bath sonicator at 65 °C for 4–5 h with frequent mixing using a vortex mixer. Additional β-mercaptoethanol was added to samples before loading onto SDS-PAGE gels. Lipid droplet proteins from 28 dishes of adipocytes were loaded onto 30-cm-long SDS-PAGE gels for staining and further identification; proteins from 2 dishes of cells were loaded onto gels for transfer to nitrocellulose membranes and immunoblotting. Gels containing greater protein loads were stained for 2 h in 0.25% Coomassie Blue G250 in 10% acetic acid, 50% methanol and then destained in 7% acetic acid, 5% methanol for 4–6 h. Proteins on gels containing samples from two dishes of adipocytes were electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes. Lipid droplets were isolated from 8 separate sets of 40 dishes of adipocytes grown and differentiated at different times; 4 sets of dishes were used for basal conditions, and 4 sets of dishes were used for lipolytically stimulated conditions. Proteins from lipid droplet preparations from 3 sets of 28 dishes of basal adipocytes were separated in 3 lanes of a single SDS-PAGE gel. Coomassie-stained bands were compared and found to be equivalent for all lanes; bands from one lane were excised for analysis by mass spectrometry. Proteins from lipid droplet preparations from 3 sets of 28 dishes of lipolytically stimulated adipocytes were separated in 3 lanes of a single SDS-PAGE gel and compared with a single lane containing proteins from 28 dishes of basal adipocytes on the same gel. Coomassie-stained bands were compared and found to vary slightly between the three preparations from the lipolytically stimulated adipocytes and significantly between basal and stimulated preparations; bands were excised for all stained proteins from two lanes of stimulated preparations and analyzed by mass spectrometry. Because some differences were obtained throughout the analysis, bands from an additional lane of proteins from 28 dishes of lipolytically stimulated adipocytes separated on a new gel were analyzed separately; all proteins reported were identified in at least 2 of the 3 analyzed preparations of proteins. In-gel Tryptic Digestion of Lipid Droplet-associated Proteins—Coomassie-stained protein bands were excised from the gels and destained with 45% acetonitrile in 100 mm ammonium bicarbonate. The resulting gel slices were incubated with 10 mm tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride, alkylated by the addition of 50 mm iodoacetamide, and then digested in situ with trypsin (100 ng per band in 50 mm ammonium bicarbonate). The tryptic peptides were extracted using POROS 20 R2 beads (Applied Biosystems) in 0.2% trifluoroacetic acid in 5% formic acid. The extracted peptides were concentrated using C18 zip-tips and eluted with 0.1% trifluoroacetic acid in 30% acetonitrile followed by 0.1% trifluoroacetic acid in 75% acetonitrile. The eluates were dried under vacuum using a Speed Vac concentrator. Mass Spectrometry—The resulting peptides were dissolved in 2–25 μl of HPLC sample solvents containing water:methanol:acetic acid: trifluoroacetic acid (70:30:0.5:0.01, v/v/v/v); the volume used was proportional to the staining intensity of the given band. Micro-HPLC-MS/MS analysis was conducted on an LCQ electrospray ionization ion trap mass spectrometer (Thermo Finnigan) coupled with an online MicroPro-HPLC system (Eldex Laboratories). Two microliters of tryptic peptide solution was injected into a Magic C18 column (0.2 × 50 mm, 5 μm, 200 Å, Michrom BioResources) which had been equilibrated with 70% solvent A (0.5% acetic acid and 0.01% trifluoroacetic acid in water: methanol (95:5, v/v)) and 30% solvent B (0.5% acetic acid and 0.01% trifluoroacetic acid in methanol:water (95:5, v/v)). Peptides were separated and eluted from the HPLC column with a linear gradient from 30 to 95% solvent B in 15 min at a flow rate of 2.0 μl/min. The eluted peptides were sprayed directly into the LCQ mass spectrometer (2.8 kV). The LCQ mass spectrometer was operated in a data-dependent mode for measuring the molecular masses of peptides (parent peptides) and collecting MS/MS peptide fragmentation spectra. Database Search and Protein Identification—The measured molecular masses of parent peptides and their MS/MS data were used to search National Center for Biotechnology Information nonredundant DNA/protein sequence database (nr) using the program KNEXUS (Genomic Solutions). The mass error tolerance used in the database search was ±3 Da for the parent ions and ±0.5 Da for the fragment ions, respectively. Protein identifications were made based on expectation values <1 × 10–2 or the quality of MS/MS spectra of peptides identified. BLAST searches were performed for hypothetical and unknown proteins. Immunoblotting of Lipid Droplet Protein Preparations—To confirm the identification of known lipid droplet-associated proteins, nitrocellulose membranes containing lipid droplet proteins were probed with antisera raised against the amino terminus of rat perilipin A (1Brasaemle D.L. Barber T. Wolins N.E. Serrero G. Blanchette-Mackie E.J. Londos C. J. Lipid Res. 1997; 38: 2249-2263Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), mouse adipophilin (Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ), mouse TIP47 (Research Diagnostics), mouse S3-12 (kindly donated by Dr. Perry Bickel (7Wolins N.E. Skinner J.R. Schoenfish M.J. Tzekov A. Bensch K.G. Bickel P.E. J. Biol. Chem. 2003; 278: 37713-37721Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar)), and caveolin-1 (kindly donated by Dr. Michael Lisanti). Microscopy—3T3-L1 adipocytes were grown and differentiated on glass coverslips; before fixation, some cells were incubated with 10 μm isoproterenol and 0.5 mm IBMX for 2 h. Cells were fixed in 3% paraformaldehyde in phosphate-buffered saline, and cells were prepared for immunofluorescence microscopy, as described previously (9Blanchette-Mackie E.J. Dwyer N.K. Barber T. Coxey R.A. Takeda T. Rondinone C.M. Theodorakis J.L. Greenberg A.S. Londos C. J. Lipid Res. 1995; 36: 1211-1226Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Primary antibody incubations included antisera raised against perilipin (1Brasaemle D.L. Barber T. Wolins N.E. Serrero G. Blanchette-Mackie E.J. Londos C. J. Lipid Res. 1997; 38: 2249-2263Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), adipophilin, S3-12 (7Wolins N.E. Skinner J.R. Schoenfish M.J. Tzekov A. Bensch K.G. Bickel P.E. J. Biol. Chem. 2003; 278: 37713-37721Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (166) Google Scholar), CGI-58 (50Subramanian V. Rothenberg A. Gomez C. Cohen A.W. Garcia A. Bhattacharyya S. Shapiro L. Dolios G. Wang R. Lisanti M. Brasaemle D.L. J. Biol. Chem. 2004; 279: 42062-42071Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (250) Google Scholar), and calnexin (StressGen Biotechnologies) for 1–3 h at room temperature. Secondary antibodies included rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (Jackson Immunoresearch, Denver, PA) for 1–2 h at room temperature; BODIPY 493/503 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) was added to secondary antibody solutions to detect neutral lipids (30Gocze P.M. Freeman D.A. Cytometry. 1994; 17: 151-158Crossref PubMed Scopus (176) Google Scholar). Cells were visualized with a Nikon Eclipse E800 fluorescence microscope equipped with a Hamamatsu Orca digital camera interfaced to a Macintosh G4 computer. Images were captured in monochrome and then processed using Improvision Openlab software; doubly stained cells are depicted in the opposite colors to those observed for esthetic reasons. Isolation of Lipid Droplets—Cultured 3T3-L1 adipocytes package stored triacylglycerol into multiple lipid droplets of varying sizes (Fig. 1A); as differentiation progresses, the lipid droplets increase in size and fuse until a few very large lipid droplets fill the majority of the cytoplasm (not shown). In preliminary experiments we found that the large lipid droplets that characterize differentiated adipocytes at 10–14 days are fragile and difficult to keep intact during isolation. Thus, to avoid these problems we isolated lipid droplets from fresh, unfrozen cells collected at 6 days after the initiation of differentiation. At 6 days, the expression of many of the proteins that characterize fully differentiated adipocytes such as perilipin, hormone-sensitive lipase, and adipose fatty acid-binding protein has been highly induced (31Cornelius P. MacDougald O.A. Lane M.D. Annu. Rev. Nutr. 1994; 14: 99-129Crossref PubMed Scopus (572) Google Scholar). To study alterations in the protein content of lipid droplets that occur during lipolytic stimulation, we incubated day 6 differentiated adipocytes with isoproterenol, an agonist of β-adren

Antibodies capable of neutralizing HIV-1 often target variable regions 1 and 2 (V1V2) of the HIV-1 envelope, but the mechanism of their elicitation has been unclear. Here we define the developmental pathway by which such antibodies are generated and acquire the requisite molecular characteristics for neutralization. Twelve somatically related neutralizing antibodies (CAP256-VRC26.01–12) were isolated from donor CAP256 (from the Centre for the AIDS Programme of Research in South Africa (CAPRISA)); each antibody contained the protruding tyrosine-sulphated, anionic antigen-binding loop (complementarity-determining region (CDR) H3) characteristic of this category of antibodies. Their unmutated ancestor emerged between weeks 30–38 post-infection with a 35-residue CDR H3, and neutralized the virus that superinfected this individual 15 weeks after initial infection. Improved neutralization breadth and potency occurred by week 59 with modest affinity maturation, and was preceded by extensive diversification of the virus population. HIV-1 V1V2-directed neutralizing antibodies can thus develop relatively rapidly through initial selection of B cells with a long CDR H3, and limited subsequent somatic hypermutation. These data provide important insights relevant to HIV-1 vaccine development. A longitudinal study of an individual patient developing neutralizing antibodies against HIV-1 (targeting the V1V2 region of gp120) reveals how such neutralizing antibodies develop and evolve over time, providing important insights relevant to vaccine development. A better understanding of how HIV-1-neutralizing antibodies are generated could be a useful contribution to the design of improved AIDS vaccines. John Mascola and colleagues have now elucidated the immunological pathway of an important category of HIV-1-neutralizing antibody — those that target the variable V1V2 region of the viral envelope. These antibodies are more frequently elicited than CD4-binding site antibodies in the early stages of HIV infection and feature modest affinity maturation, a process that favours mutations in antibody variable domains that enhance antigen binding.

Cadherins are transmembrane proteins that mediate adhesion between cells in the solid tissues of animals. Here we present the 3.1 angstrom resolution crystal structure of the whole, functional extracellular domain from C-cadherin, a representative “classical” cadherin. The structure suggests a molecular mechanism for adhesion between cells by classical cadherins, and it provides a new framework for understanding both cis (same cell) and trans (juxtaposed cell) cadherin interactions. The trans adhesive interface is a twofold symmetric interaction defined by a conserved tryptophan side chain at the membrane-distal end of a cadherin molecule from one cell, which inserts into a hydrophobic pocket at the membrane-distal end of a cadherin molecule from the opposing cell.

Abstract

 ACRP30 – adipocyte complement-related protein of 30 kDa or AdipoQ – is an abundant serum protein, secreted exclusively from fat cells, which is implicated in energy homeostasis and obesity [1,2]. ACRP30 is a close homologue of the complement protein C1q, which is involved in the recognition of microbial surfaces [3–5] and antibody–antigen complexes [6,7] in the classical pathway of complement. We have determined the crystal structure of a homotrimeric fragment from ACRP30 at 2.1 å resolution. The structure reveals an unexpected homology to the tumor necrosis factor (TNF) family. Identical folding topologies, key residue conservations, and similarity of trimer interfaces and intron positions firmly establish an evolutionary link between the TNF and C1q families. We suggest that TNFs – which control many aspects of inflammation, adaptive immunity, apoptosis and energy homeostasis – arose by divergence from a primordial recognition molecule of the innate immune system. The evolutionary connection between C1q-like proteins and TNFs illuminates the shared functions of these two important groups of proteins.