Abstract Understanding the molecular mechanisms underlying mammalian kidney function requires transcriptome profiling of the interplay between cells comprising nephron segments. Traditional transcriptomics requires cell dissociation, resulting in loss of the spatial context of gene expression within native tissue. To address this problem, we performed spatial transcriptomics (ST) to retain the spatial context of the transcriptome in human and mouse kidneys. The generated ST data allowed spatially resolved differential gene expression analysis, spatial identification of functional nephron segments, cell-to-cell interaction analysis, and chronic kidney disease-associated genetic variant calling. Novel ST thus provides an opportunity to enhance kidney diagnostics and knowledge, by retaining the spatial context of gene expression within intact tissue.

ABSTRACT Purpose The liver is the most frequent metastatic site for colorectal cancer ( CRC ). Its microenvironment is modified to provide a niche that allows CRC cell growth. This study focused on characterizing the cellular changes in the metastatic CRC ( mCRC ) liver tumor microenvironment ( TME ). Experimental Design We analyzed a series of microsatellite stable (MSS) mCRCs to the liver, paired normal liver tissue and peripheral blood mononuclear cells using single cell RNA-seq ( scRNA-seq ). We validated our findings using multiplexed spatial imaging and bulk gene expression with cell deconvolution. Results We identified TME-specific SPP1 -expressing macrophages with altered metabolism features, foam cell characteristics and increased activity for extracellular matrix ( ECM ) organization. SPP1+ macrophages and fibroblasts expressed complementary ligand receptor pairs with the potential to mutually influence their gene expression programs. TME lacked dysfunctional CD8 T cells and contained regulatory T cells, indicative of immunosuppression. Spatial imaging validated these cell states in the TME. Moreover, TME macrophages and fibroblasts had close spatial proximity, a requirement for intercellular communication and networking. In an independent cohort of mCRCs in the liver, we confirmed the presence of SPP1 + macrophages and fibroblasts using gene expression data. An increased proportion of TME fibroblasts was associated with worst prognosis in these patients. Conclusions We demonstrated that mCRC in the liver is characterized by transcriptional alterations of macrophages in the TME. Intercellular networking between macrophages and fibroblasts supports CRC growth in the immunosuppressed metastatic niche in the liver. These features can be used to target these immune checkpoint resistant MSS tumors. TRANSLATIONAL RELEVANCE The liver is the commonest site for metastatic colorectal cancer ( mCRC ). Alterations in the tumor microenvironment ( TME ) allow metastatic cells to seed the distant liver site and grow. Leveraging single-cell RNA sequencing, we discovered a distinct SPP1 + macrophage cell state with pro-fibrogenic gene expression and altered metabolism. These SPP1 + macrophages communicated with fibroblasts, mutually influencing each other’s gene expression program. Using spatial imaging, we confirmed proximal colocalization between macrophages and fibroblasts in the mCRC TME, which is required for intercellular communication. These states and intercellular communication promoted immunosuppression in the TME, with a lack of dysfunctional anti-tumor CD8 T cells and prevalence of regulatory T cells. Increased fibroblasts were associated with worst prognosis in an independent patient cohort. Our results identified novel TME features that result in reshaping of the metastatic niche that allows progression of mCRC. These features can be potential targets for mCRC treatment, which is microsatellite stable and resistant to immune checkpoint blockade.

ABSTRACT Deep learning cancer classification systems have the potential to improve cancer diagnosis. However, development of these computational approaches depends on prior annotation through a pathologist. This initial step relying on a manual, low-resolution, time-consuming process is highly variable and subject to observer variance. To address this issue, we developed a novel method, H&E Molecular neural network (HEMnet). This two-step process utilises immunohistochemistry as an initial molecular label for cancer cells on a H&E image and then we train a cancer classifier on the overlapping clinical histopathological images. Using this molecular transfer method, we show that HEMnet accurately distinguishes colorectal cancer from normal tissue at high resolution without the need for an initial manual histopathologic evaluation. Our validation study using histopathology images from TCGA samples accurately estimates tumour purity. Overall, our method provides a path towards a fully automated delineation of any type of tumor so long as there is a cancer-oriented molecular stain available for subsequent learning. Software, tutorials and interactive tools are available at: https://github.com/BiomedicalMachineLearning/HEMnet

ABSTRACT Spatial Transcriptomics is an emerging technology that adds spatial dimensionality and tissue morphology to the genome-wide transcriptional profile of cells in an undissociated tissue. Integrating these three types of data creates a vast potential for deciphering novel biology of cell types in their native morphological context. Here we developed innovative integrative analysis approaches to utilise all three data types to first find cell types, then reconstruct cell type evolution within a tissue, and search for tissue regions with high cell-to-cell interactions. First, for normalisation of gene expression, we compute a distance measure using morphological similarity and neighbourhood smoothing. The normalised data is then used to find clusters that represent transcriptional profiles of specific cell types and cellular phenotypes. Clusters are further sub-clustered if cells are spatially separated. Analysing anatomical regions in three mouse brain sections and 12 human brain datasets, we found the spatial clustering method more accurate and sensitive than other methods. Second, we introduce a method to calculate transcriptional states by pseudo-space-time (PST) distance. PST distance is a function of physical distance (spatial distance) and gene expression distance (pseudotime distance) to estimate the pairwise similarity between transcriptional profiles among cells within a tissue. We reconstruct spatial transition gradients within and between cell types that are connected locally within a cluster, or globally between clusters, by a directed minimum spanning tree optimisation approach for PST distance. The PST algorithm could model spatial transition from non-invasive to invasive cells within a breast cancer dataset. Third, we utilise spatial information and gene expression profiles to identify locations in the tissue where there is both high ligand-receptor interaction activity and diverse cell type co-localisation. These tissue locations are predicted to be hotspots where cell-cell interactions are more likely to occur. We detected tissue regions and ligand-receptor pairs significantly enriched compared to background distribution across a breast cancer tissue. Together, these three algorithms, implemented in a comprehensive Python software stLearn, allow for the elucidation of biological processes within healthy and diseased tissues.

Abstract The SARS-CoV-2 (COVID-19) virus has caused a devastating global pandemic of respiratory illness. To understand viral pathogenesis, methods are available for studying dissociated cells in blood, nasal samples, bronchoalveolar lavage fluid, and similar, but a robust platform for deep tissue characterisation of molecular and cellular responses to virus infection in the lungs is still lacking. We developed an innovative spatial multi-omics platform to investigate COVID-19-infected lung tissues. Five tissue-profiling technologies were combined by a novel computational mapping methodology to comprehensively characterise and compare the transcriptome and targeted proteome of virus infected and uninfected tissues. By integrating spatial transcriptomics data (Visium, GeoMx and RNAScope) and proteomics data (CODEX and PhenoImager HT) at different cellular resolutions across lung tissues, we found strong evidence for macrophage infiltration and defined the broader microenvironment surrounding these cells. By comparing infected and uninfected samples, we found an increase in cytokine signalling and interferon responses at different sites in the lung and showed spatial heterogeneity in the expression level of these pathways. These data demonstrate that integrative spatial multi-omics platforms can be broadly applied to gain a deeper understanding of viral effects on cellular environments at the site of infection and to increase our understanding of the impact of SARS-CoV-2 on the lungs.

Spatial transcriptomics is a breakthrough technology that enables spatially-resolved measurement of molecular profiles in tissues, opening the opportunity for integrated analyses of morphology and transcriptional profiles through paired imaging and gene expression data. However, the high cost of generating data has limited its widespread adoption. Predicting gene expression profiles from histology images only can be an effective and cost-efficient in-silico spatial transcriptomics solution but is computationally challenging and current methods are limited in model performance. To advance research in this emerging and important field, this study makes the following contributions. We first provide a systematic review of deep learning methods for predicting gene expression profiles from histology images, highlighting similarities and differences in algorithm, model architecture, and data processing pipelines. Second, we performed extensive experiments to evaluate the generalization performance of the reviewed methods on several spatial transcriptomics datasets for breast cancer, where the datasets are generated using different technologies. Lastly, we propose several ideas for model improvement and empirically investigate their effectiveness. Our results shed insight on key features in a neural network model that either improve or not the performance of in-silico spatial transcriptomics, and we highlight challenges in developing algorithms with strong generalization performance.

Abstract Spatial transcriptomic (ST) data enables us to link tissue morphological features with thousands of unseen gene expression values, opening a horizon for breakthroughs in digital pathology. Models to predict the presence/absence, high/low, or continuous expression of a gene using images as the only input have a huge potential clinical applications, but such models require improvements in accuracy, interpretability, and robustness. We developed STimage models to estimate parameters of gene expression as distributions rather than fixed data points, thereby allowing for the essential quantification of uncertainty in the predicted results. We assessed aleatoric and epistemic uncertainty of the models across a diverse range of test cases and proposed an ensemble approach to improve the model performance and trust. STimage can train prediction models for one gene marker or a panel of markers and provides important interpretability analyses at a single-cell level, and in the histopathological annotation context. Through a comprehensive benchmarking with existing models, we found that STimage is more robust to technical variation in platforms, data types, and sample types. Using images from the cancer genome atlas, we showed that STimage can be applied to non-spatial omics data. STimage also performs better than other models when only a small training dataset is available. Overall, STimage contributes an important methodological advance needed for the potential application of spatial technology in cancer digital pathology.

Abstract Immune checkpoint inhibitor (ICI) modality has had a limited success (<20%) in treating metastatic recurrent Head & Neck Oropharyngeal Squamous cell carcinomas (OPSCCs). To improve response rates to ICIs, tailored approaches capable to capture the tumor complexity and dynamics of each patient’s disease are needed. Here, we performed advanced analyses of spatial proteogenomic technologies to demonstrate that: (i) compared to standard histopathology, spatial transcriptomics better-identified tumor cells and could specifically classify them into two different metabolic states with therapeutic implications; (ii) our new method (Spatial Proteomics-informed cell deconvolution method or SPiD ) improved profiling of local immune cell types relevant to disease progression, (iii) identified clinically relevant alternative treatments and a rational explanation for checkpoint inhibitor therapy failure through comparative analysis of pre- and post-failure tumor data and, (iv) discovered ligand-receptor interactions as potential lead targets for personalized drug treatments. Our work establishes a clear path for incorporating spatial-omics in clinical settings to facilitate treatment personalization.

Specific interactions between proteins and DNA are essential to many biological processes. Yet it remains unclear how the diversification in DNA-binding specificity was brought about, and what were the mutational paths that led to changes in specificity. Using a pair of evolutionarily related DNA-binding proteins each with a different DNA preference (ParB and Noc: both having roles in bacterial chromosome maintenance), we show that specificity is encoded by a set of four residues at the protein-DNA interface. Combining X-ray crystallography and deep mutational scanning of the interface, we show that permissive mutations must be introduced before specificity-switching mutations to reprogram specificity, and that mutational paths to a new specificity do not necessarily involve dual-specificity intermediates. Overall, our results provide a glimpse into the possible evolutionary history of ParB and Noc, and in a broader context, might be useful in understanding the evolution of other classes of DNA-binding proteins.

Spatial transcriptomics technology is increasingly being applied because it enables the measurement of spatial gene expression in an intact tissue along with imaging morphology of the same tissue. However, current analysis methods for spatial transcriptomics data do not use image pixel information, thus missing the quantitative links between gene expression and tissue morphology. We developed a user-friendly deep learning software, SpaCell, to integrate millions of pixel intensity values with thousands of gene expression measurements from spatially-barcoded spots in a tissue. We show the integration approach outperforms the use of gene count alone or imaging data alone to create deep learning models to identify cell types or predict labels of tissue images with high resolution and accuracy.