Cardiomyocytes (CMs) from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are functionally immature, but this is improved by incorporation into engineered tissues or forced contraction. Here, we showed that tri-cellular combinations of hiPSC-derived CMs, cardiac fibroblasts (CFs), and cardiac endothelial cells also enhance maturation in easily constructed, scaffold-free, three-dimensional microtissues (MTs). hiPSC-CMs in MTs with CFs showed improved sarcomeric structures with T-tubules, enhanced contractility, and mitochondrial respiration and were electrophysiologically more mature than MTs without CFs. Interactions mediating maturation included coupling between hiPSC-CMs and CFs through connexin 43 (CX43) gap junctions and increased intracellular cyclic AMP (cAMP). Scaled production of thousands of hiPSC-MTs was highly reproducible across lines and differentiated cell batches. MTs containing healthy-control hiPSC-CMs but hiPSC-CFs from patients with arrhythmogenic cardiomyopathy strikingly recapitulated features of the disease. Our MT model is thus a simple and versatile platform for modeling multicellular cardiac diseases that will facilitate industry and academic engagement in high-throughput molecular screening.

ABSTRACT Gene expression heterogeneity in the pluripotent state of mouse embryonic stem cells (mESCs) has been increasingly well-characterized. In contrast, exit from pluripotency and lineage commitment have not been studied systematically at the single-cell level. Here we measured the gene expression dynamics of retinoic acid driven mESC differentiation using an unbiased single-cell transcriptomics approach. We found that the exit from pluripotency marks the start of a lineage bifurcation as well as a transient phase of susceptibility to lineage specifying signals. Our study revealed several transcriptional signatures of this phase, including a sharp increase of gene expression variability. Importantly, we observed a handover between two classes of transcription factors. The early-expressed class has potential roles in lineage biasing, the late-expressed class in lineage commitment. In summary, we provide a comprehensive analysis of lineage commitment at the single cell level, a potential stepping stone to improved lineage control through timing of differentiation cues.

Abstract Gastruloids have emerged as highly useful in vitro models of mammalian gastrulation. One of the most striking features of 3D gastruloids is their elongation, which mimics the extension of the embryonic anterior-posterior axis. Although axis extension is crucial for development, the underlying mechanism has not been fully elucidated in mammalian species. Gastruloids provide an opportunity to study this morphogenic process in vitro . Here, we measure and quantify the shapes of elongating gastruloids and show, by Cellular Potts model simulations, that a combination of convergent extension and differential adhesion can explain the observed shapes. We reveal that differential adhesion alone is insufficient and also directly observe hallmarks of convergent extension by time-lapse imaging of gastruloids. Finally, we show that gastruloid elongation can be abrogated by inhibition of the Rho kinase pathway, which is involved in convergent extension in vivo . All in all, our study demonstrates, how gastruloids can be used to elucidate morphogenic processes in embryonic development.

ABSTRACT Each tissue and organ in the body has its own type of vasculature. Here we demonstrate that organotypic vasculature for the heart can be recreated in a three-dimensional cardiac microtissue (MT) model composed of human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs) and endothelial cells (ECs). ECs in cardiac MTs upregulated expression of markers enriched in human intramyocardial ECs (iECs), such as CD36, CLDN5, APLNR, NOTCH4, IGFBP3, ARHGAP18 , which were previously identified in the single-cell RNA-seq dataset from the human fetal heart (6.5-7 weeks post coitum). We further show that the local microenvironment largely dictates the organ-specific identity of hiPSC-derived ECs: we compared ECs of different developmental origins derived from two distinct mesoderm subtypes (cardiac and paraxial mesoderm) and found that independent of whether the ECs were cardiac or paraxial mesoderm derived, they acquired similar identities upon integration into cardiac microtissues. This was confirmed by single-cell RNA-seq. Overall, the results indicated that whilst the initial gene profile of ECs was dictated by developmental origin, this could be modified by the local tissue environment such that the original identity was lost and the organotypic identity acquired through local environmental signals. This developmental “plasticity” in ECs has implications for multiple pathological and disease states.

ABSTRACT The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) efficiently into defined cardiac lineages, such as cardiomyocytes and cardiac endothelial cells, is crucial to study human heart development and model cardiovascular diseases in vitro . The mechanisms underlying the specification of these cell types during human development are not well-understood which limits fine-tuning and broader application of cardiac model systems. Here, we used the expression of ETV2, a master regulator of hematoendothelial specification in mice, to identify functionally distinct subpopulations during the co-differentiation of endothelial cells and cardiomyocytes from hiPSCs. Targeted analysis of single-cell RNA sequencing data revealed differential ETV2 dynamics in the two lineages. A newly created fluorescent reporter line allowed us to identify early lineage-predisposed states and show that a transient ETV2-high state initiates the specification of endothelial cells. We further demonstrated, unexpectedly, that functional cardiomyocytes can originate from progenitors expressing ETV2 at a low level. Our study thus sheds light on the in vitro differentiation dynamics of two important cardiac lineages. SIGNIFICANCE STATEMENT In vitro differentiation of cardiac cell types is of great importance for understanding heart development, disease modeling and future regenerative medicine. Currently, underlying molecular mechanisms are incompletely understood, which limits the efficiency and fine-tuning of present differentiation protocols. Here, we investigated the master regulator ETV2 and showed that its upregulation marks the specification of two cardiac cell types during co-differentiation. Using single-cell RNA-seq and a new fluorescent reporter line we identified lineage-predisposed subpopulations in the ETV2+ cells. We thus resolved ETV2 dynamics at the single-cell level in the context of in vitro human cardiac differentiation.

During in vitro differentiation, pluripotent stem cells undergo extensive remodeling of their gene expression profile. While studied extensively at the transcriptome level, much less is known about protein dynamics. Here, we measured mRNA and protein levels of 7459 genes during differentiation of embryonic stem cells (ESCs). This comprehensive data set revealed pervasive discordance between mRNA and protein. The high temporal resolution of the data made it possible to determine protein turnover rates genome-wide by fitting a kinetic model. This model further enabled us to systematically identify dynamic post-transcriptional regulation. Moreover, we linked different modes of regulation to the function of specific gene sets. Finally, we showed that the kinetic model can be applied to single-cell transcriptomics data to predict protein levels in differentiated cell types. In conclusion, our comprehensive data set, easily accessible through a web application, is a valuable resource for the discovery of post-transcriptional regulation in ESC differentiation.

Abstract The ability to discover new cell populations by unsupervised clustering of single-cell transcriptomics data has revolutionized biology. Currently, there is no principled way to decide, whether a cluster of cells contains meaningful subpopulations that should be further resolved. Here we present SIGMA, a clusterability measure derived from random matrix theory, that can be used to identify cell clusters with non-random sub-structure, testably leading to the discovery of previously overlooked phenotypes.

Cell-based therapies are bound to revolutionize medicine, but significant technical hurdles must be overcome before wider adoption. In particular, nondestructive, label-free methods to characterize cells in real time are needed to optimize the production process and improve quality control. Raman spectroscopy, which provides a fingerprint of a cell's chemical composition, would be an ideal modality but is too slow for high-throughput applications. Compressive Raman techniques, which measure only linear combinations of Raman intensities, can be fast but require careful optimization to deliver high performance. Here, we develop a neural network model to identify optimal parameters for a compressive sensing scheme that reduces measurement time by 2 orders of magnitude. In a data set containing Raman spectra of three different cell types, it achieves up to 90% classification accuracy using only five linear combinations of Raman intensities. Our method thus unlocks the power of Raman spectroscopy for the characterization of cell products.

Understanding the regulation and structure of ribosomes is essential to understanding protein synthesis and its dysregulation in disease. While ribosomes are believed to have a fixed stoichiometry among their core ribosomal proteins (RPs), some experiments suggest a more variable composition. Testing such variability requires direct and precise quantification of RPs. We used mass-spectrometry to directly quantify RPs across monosomes and polysomes of mouse embryonic stem cells (ESC) and budding yeast. Our data show that the stoichiometry among core RPs in wild-type yeast cells and ESC depends both on the growth conditions and on the number of ribosomes bound per mRNA. Furthermore, we find that the fitness of cells with a deleted RP-gene is inversely proportional to the enrichment of the corresponding RP in polysomes. Together, our findings support the existence of ribosomes with distinct protein composition and physiological function.

The emergence of brain organoids has revolutionized our understanding of neurodevelopment and neurological diseases by providing an in vitro model system that recapitulates key aspects of human brain development. However, conventional organoid protocols often overlook the role of microglia, the resident immune cells of the central nervous system. Microglia dysfunction is implicated in various neurological disorders, highlighting the need for their inclusion in organoid models. Here, we present a novel method for generating neuroimmune assembloids using human-induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cortical organoids and microglia. Building upon our previous work generating myelinating cortical organoids, we extend our methodology to include the integration of microglia, ensuring their long-term survival and maturation within the organoids. We describe two integration methods: one involving direct addition of microglia progenitors to the organoids and an alternative approach where microglia and dissociated neuronal progenitors are aggregated together in a defined ratio. To facilitate downstream analysis, we also describe a dissociation protocol for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and provide guidance on fixation, cryosectioning, and immunostaining of assembloid structures. Overall, our protocol provides a comprehensive framework for generating neuroimmune assembloids, offering researchers a valuable tool for studying the interactions between neural cell types and immune cells in the context of neurological diseases.