Neuronal types in the central nervous system differ dramatically in their resilience to injury or other insults. Here we studied the selective resilience of mouse retinal ganglion cells (RGCs) following optic nerve crush (ONC), which severs their axons and leads to death of ∼80% of RGCs within 2 weeks. To identify expression programs associated with differential resilience, we first used single-cell RNA-seq (scRNA-seq) to generate a comprehensive molecular atlas of 46 RGC types in adult retina. We then tracked their survival after ONC; characterized transcriptomic, physiological, and morphological changes that preceded degeneration; and identified genes selectively expressed by each type. Finally, using loss- and gain-of-function assays in vivo, we showed that manipulating some of these genes improved neuronal survival and axon regeneration following ONC. This study provides a systematic framework for parsing type-specific responses to injury and demonstrates that differential gene expression can be used to reveal molecular targets for intervention.

Abstract Non-neuronal cells play key roles in the complex cellular interplay that follows central nervous system (CNS) insult. To understand this interplay at a tissue level, we generated a single-cell atlas of immune, glial and retinal pigment epithelial cells from adult mouse retina before and at multiple time points after axonal transection (optic nerve crush; ONC), identifying rare and undescribed subsets, and delineating changes in cell composition, expression programs, and interactions. Computational analysis charted an inflammatory cascade after injury with three phases. The early phase consisted of reactivation of retinal macroglia and microglia, providing chemotactic signals for immune infiltration, concurrent with infiltration of CCR2 + monocytes from the circulation. In the second phase, these differentiated to macrophage subsets resembling resident border-associated macrophages. In parallel, a multicellular interferon program, likely driven by microglia-derived type-I interferon, was synchronously activated across resident glia, expanding beyond rare interferon-responding subsets of glia unexpectedly present in the naïve retina. Our findings provide insights regarding post-injury CNS tissue dynamics and a framework to decipher cellular circuitry, spatial relationships and molecular interactions following tissue injury.

The COVID-19 pandemic, caused by the novel coronavirus SARS-CoV-2, creates an urgent need for identifying molecular mechanisms that mediate viral entry, propagation, and tissue pathology. Cell membrane bound angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and associated proteases, transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2) and Cathepsin L (CTSL), were previously identified as mediators of SARS-CoV2 cellular entry. Here, we assess the cell type-specific RNA expression of ACE2, TMPRSS2, and CTSL through an integrated analysis of 107 single-cell and single-nucleus RNA-Seq studies, including 22 lung and airways datasets (16 unpublished), and 85 datasets from other diverse organs. Joint expression of ACE2 and the accessory proteases identifies specific subsets of respiratory epithelial cells as putative targets of viral infection in the nasal passages, airways, and alveoli. Cells that co-express ACE2 and proteases are also identified in cells from other organs, some of which have been associated with COVID-19 transmission or pathology, including gut enterocytes, corneal epithelial cells, cardiomyocytes, heart pericytes, olfactory sustentacular cells, and renal epithelial cells. Performing the first meta-analyses of scRNA-seq studies, we analyzed 1,176,683 cells from 282 nasal, airway, and lung parenchyma samples from 164 donors spanning fetal, childhood, adult, and elderly age groups, associate increased levels of ACE2, TMPRSS2, and CTSL in specific cell types with increasing age, male gender, and smoking, all of which are epidemiologically linked to COVID-19 susceptibility and outcomes. Notably, there was a particularly low expression of ACE2 in the few young pediatric samples in the analysis. Further analysis reveals a gene expression program shared by ACE2+TMPRSS2+ cells in nasal, lung and gut tissues, including genes that may mediate viral entry, subtend key immune functions, and mediate epithelial-macrophage cross-talk. Amongst these are IL6, its receptor and co-receptor, IL1R, TNF response pathways, and complement genes. Cell type specificity in the lung and airways and smoking effects were conserved in mice. Our analyses suggest that differences in the cell type-specific expression of mediators of SARS-CoV-2 viral entry may be responsible for aspects of COVID-19 epidemiology and clinical course, and point to putative molecular pathways involved in disease susceptibility and pathogenesis.### Competing Interest StatementN.K. was a consultant to Biogen Idec, Boehringer Ingelheim, Third Rock, Pliant, Samumed, NuMedii, Indaloo, Theravance, LifeMax, Three Lake Partners, Optikira and received non-financial support from MiRagen. All of these outside the work reported. J.L. is a scientific consultant for 10X Genomics Inc A.R. is a co-founder and equity holder of Celsius Therapeutics, an equity holder in Immunitas, and an SAB member of ThermoFisher Scientific, Syros Pharmaceuticals, Asimov, and Neogene Therapeutics O.R.R., is a co-inventor on patent applications filed by the Broad Institute to inventions relating to single cell genomics applications, such as in PCT/US2018/060860 and US Provisional Application No. 62/745,259. A.K.S. compensation for consulting and SAB membership from Honeycomb Biotechnologies, Cellarity, Cogen Therapeutics, Orche Bio, and Dahlia Biosciences. S.A.T. was a consultant at Genentech, Biogen and Roche in the last three years. F.J.T. reports receiving consulting fees from Roche Diagnostics GmbH, and ownership interest in Cellarity Inc. L.V. is funder of Definigen and Bilitech two biotech companies using hPSCs and organoid for disease modelling and cell based therapy.

Neuronal types in the central nervous system differ dramatically in their resilience to injury or insults. Here we studied the selective resilience of mouse retinal ganglion cells (RGCs) following optic nerve crush (ONC), which severs their axons and leads to death of ~80% of RGCs within 2 weeks. To identify expression programs associated with differential resilience, we first used single-cell RNA-seq (scRNA-seq) to generate a comprehensive molecular atlas of 46 RGC types in adult retina. We then tracked their survival after ONC, characterized transcriptomic, physiological, and morphological changes that preceded degeneration, and identified genes selectively expressed by each type. Finally, using loss- and gain-of-function assays in vivo, we showed that manipulating some of these genes improved neuronal survival and axon regeneration following ONC. This study provides a systematic framework for parsing type-specific responses to injury, and demonstrates that differential gene expression can be used to reveal molecular targets for intervention.

Amacrine cells (ACs) are a diverse class of interneurons that modulate input from photoreceptors to retinal ganglion cells (RGCs), rendering each RGC type selectively sensitive to particular visual features, which are then relayed to the brain. While many AC types have been identified morphologically and physiologically, they have not been comprehensively classified or molecularly characterized. We used high-throughput single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to profile >32,000 ACs from mouse retina, and applied computational methods to identify 63 AC types. We identified molecular markers for each type, and used them to characterize the morphology of multiple types. We show that they include nearly all previously known AC types as well as many that had not been described. Consistent with previous studies, most of the AC types express markers for the canonical inhibitory neurotransmitters GABA or glycine, but several express neither or both. In addition, many express one or more neuropeptides, and two express glutamatergic markers. We also explored transcriptomic relationships among AC types and identified transcription factors expressed by individual or multiple closely related types. Noteworthy among these were Meis2 and Tcf4, expressed by most GABAergic and most glycinergic types, respectively. Together, these results provide a foundation for developmental and functional studies of ACs, as well as means for genetically accessing them. Along with previous molecular, physiological and morphological analyses, they establish the existence of at least 130 neuronal types and nearly 140 cell types in mouse retina.