ABSTRACT The anterior segment of the eye consists of the cornea, iris, ciliary body, crystalline lens and aqueous humor outflow pathways. Together, these tissues are essential for the proper functioning of the eye. Disorders of vision have been ascribed to defects in all of them; some, including glaucoma and cataract, are among the most prevalent causes of blindness in the world. To characterize the cell types that comprise these tissues, we generated an anterior segment cell atlas of the human eye using high throughput single-nucleus RNA sequencing (snRNAseq). We profiled 191,992 nuclei from non-diseased anterior segment tissues from 6 human donors, identifying >60 cell types. Many of these cell types were discrete, whereas others, especially in lens and cornea, formed continua corresponding to known developmental transitions that persist in adulthood. Having profiled each tissue separately, we performed an integrated analysis of the entire anterior segment revealing that some cell types are unique to single structure whereas others are shared across tissues. The integrated cell atlas was then used to investigate cell type-specific expression patterns of more than 900 human ocular disease genes identified either through Mendelian inheritance patterns or genome-wide association studies (GWAS). SIGNIFICANCE STATEMENT Several of the most prevalent blinding ocular conditions worldwide, including glaucoma, cataract and uncorrected refractive error, involve structures of the anterior segment of the human eye, which consists of the cornea, iris, ciliary body, crystalline lens and aqueous humor outflow pathways. In addition to providing transcriptomic profiles of the cell types within individual tissues, this work contributes to our understanding of the relatedness and diversity of these cell types across contiguous tissues by generating an integrated anterior segment cell atlas and documenting the expression of over 900 disease-associated genes in each cell type. By allowing simultaneous interrogation of cell-type specific expression of genes across multiple tissues, the atlas may yield broad insight into normal and disease-associated anterior segment functions.

Increased intraocular pressure (IOP) represents a major risk factor for glaucoma, a prevalent eye disease characterized by death of retinal ganglion cells that carry information from the eye to the brain; lowering IOP is the only proven treatment strategy to delay disease progression. The main determinant of IOP is the equilibrium between production and drainage of aqueous humor, with compromised drainage generally viewed as the primary contributor to dangerous IOP elevations. Drainage occurs through two pathways in the anterior segment of the eye, called conventional and uveoscleral. To gain insights into the cell types that comprise these pathways, we used high-throughput single cell RNA sequencing (scRNA-seq). From ~24,000 single cell transcriptomes, we identified 19 cell types with molecular markers for each and used histological methods to localize each type. We then performed similar analyses on four organisms used for experimental studies of IOP dynamics and glaucoma: cynomolgus macaque (Macaca fascicularis), rhesus macaque (Macaca mulatta), pig (Sus scrofa) and mouse (Mus musculus). Many human cell types had counterparts in these models, but differences in cell types and gene expression were evident. Finally, we identified the cell types that express genes implicated in glaucoma in all five species. Together, our results provide foundations for investigating the pathogenesis of glaucoma, and for using model systems to assess mechanisms and potential interventions.

The COVID-19 pandemic, caused by the novel coronavirus SARS-CoV-2, creates an urgent need for identifying molecular mechanisms that mediate viral entry, propagation, and tissue pathology. Cell membrane bound angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and associated proteases, transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2) and Cathepsin L (CTSL), were previously identified as mediators of SARS-CoV2 cellular entry. Here, we assess the cell type-specific RNA expression of ACE2, TMPRSS2, and CTSL through an integrated analysis of 107 single-cell and single-nucleus RNA-Seq studies, including 22 lung and airways datasets (16 unpublished), and 85 datasets from other diverse organs. Joint expression of ACE2 and the accessory proteases identifies specific subsets of respiratory epithelial cells as putative targets of viral infection in the nasal passages, airways, and alveoli. Cells that co-express ACE2 and proteases are also identified in cells from other organs, some of which have been associated with COVID-19 transmission or pathology, including gut enterocytes, corneal epithelial cells, cardiomyocytes, heart pericytes, olfactory sustentacular cells, and renal epithelial cells. Performing the first meta-analyses of scRNA-seq studies, we analyzed 1,176,683 cells from 282 nasal, airway, and lung parenchyma samples from 164 donors spanning fetal, childhood, adult, and elderly age groups, associate increased levels of ACE2, TMPRSS2, and CTSL in specific cell types with increasing age, male gender, and smoking, all of which are epidemiologically linked to COVID-19 susceptibility and outcomes. Notably, there was a particularly low expression of ACE2 in the few young pediatric samples in the analysis. Further analysis reveals a gene expression program shared by ACE2+TMPRSS2+ cells in nasal, lung and gut tissues, including genes that may mediate viral entry, subtend key immune functions, and mediate epithelial-macrophage cross-talk. Amongst these are IL6, its receptor and co-receptor, IL1R, TNF response pathways, and complement genes. Cell type specificity in the lung and airways and smoking effects were conserved in mice. Our analyses suggest that differences in the cell type-specific expression of mediators of SARS-CoV-2 viral entry may be responsible for aspects of COVID-19 epidemiology and clinical course, and point to putative molecular pathways involved in disease susceptibility and pathogenesis.### Competing Interest StatementN.K. was a consultant to Biogen Idec, Boehringer Ingelheim, Third Rock, Pliant, Samumed, NuMedii, Indaloo, Theravance, LifeMax, Three Lake Partners, Optikira and received non-financial support from MiRagen. All of these outside the work reported. J.L. is a scientific consultant for 10X Genomics Inc A.R. is a co-founder and equity holder of Celsius Therapeutics, an equity holder in Immunitas, and an SAB member of ThermoFisher Scientific, Syros Pharmaceuticals, Asimov, and Neogene Therapeutics O.R.R., is a co-inventor on patent applications filed by the Broad Institute to inventions relating to single cell genomics applications, such as in PCT/US2018/060860 and US Provisional Application No. 62/745,259. A.K.S. compensation for consulting and SAB membership from Honeycomb Biotechnologies, Cellarity, Cogen Therapeutics, Orche Bio, and Dahlia Biosciences. S.A.T. was a consultant at Genentech, Biogen and Roche in the last three years. F.J.T. reports receiving consulting fees from Roche Diagnostics GmbH, and ownership interest in Cellarity Inc. L.V. is funder of Definigen and Bilitech two biotech companies using hPSCs and organoid for disease modelling and cell based therapy.