To broaden our understanding of the evolution of gene regulation mechanisms, we generated occupancy profiles for 34 orthologous transcription factors (TFs) in human–mouse erythroid progenitor, lymphoblast and embryonic stem-cell lines. By combining the genome-wide transcription factor occupancy repertoires, associated epigenetic signals, and co-association patterns, here we deduce several evolutionary principles of gene regulatory features operating since the mouse and human lineages diverged. The genomic distribution profiles, primary binding motifs, chromatin states, and DNA methylation preferences are well conserved for TF-occupied sequences. However, the extent to which orthologous DNA segments are bound by orthologous TFs varies both among TFs and with genomic location: binding at promoters is more highly conserved than binding at distal elements. Notably, occupancy-conserved TF-occupied sequences tend to be pleiotropic; they function in several tissues and also co-associate with many TFs. Single nucleotide variants at sites with potential regulatory functions are enriched in occupancy-conserved TF-occupied sequences. As part of the mouse ENCODE project, genome-wide transcription factor (TF) occupancy repertoires and co-association patterns in mice and humans are studied; many aspects are conserved but the extent to which orthologous DNA segments are bound by TFs in mice and humans varies both among TFs and genomic location, and TF-occupied sequences whose occupancy is conserved tend to be pleiotropic and enriched for single nucleotide variants with known regulatory potential. As part of the mouse ENCODE project Mike Snyder and colleagues studied the genome-wide transcription factor (TF) occupancy repertoires, associated epigenetic signals, and TF co-association patterns in mice and humans to broaden our understanding of the evolution of gene regulation mechanisms in mammals. The results indicate that although many aspects of TF occupied sequences are conserved in both species, the extent to which orthologous DNA segments are bound by orthologous TFs in human and mouse varies both among TFs and with genomic location. Importantly, TF occupied sequences with conserved occupancy tend to be pleiotropic; they are also enriched for single nucleotide variants (SNVs) that are known to have regulatory potential or are associated with known phenotypes.

Abstract Transcriptional enhancers are a predominant class of noncoding regulatory elements that activate cell type-specific gene expression. Tissue-specific enhancer-associated chromatin signatures have proven useful to identify candidate enhancer elements at a genome-wide scale, but their sensitivity for the comprehensive detection of all enhancers active in a given tissue in vivo remains unclear. Here we show that a substantial proportion of in vivo enhancers are hidden from discovery by conventional chromatin profiling methods. In an initial comparison of over 1,200 in vivo validated tissue-specific enhancers with tissue-matched mouse developmental epigenome data, 14% (n=286) of active enhancers did not show canonical enhancer-associated chromatin signatures in the tissue in which they are active. To assess the prevalence of enhancers not detectable by conventional chromatin profiling approaches in more detail, we used a high throughput transgenic enhancer reporter assay to systematically screen over 1.3 Mb of mouse genomic sequence at two critical developmental loci, assessing a total of 281 consecutive 5kb regions for in vivo enhancer activity in mouse embryos. We observed reproducible enhancer-reporter activity in 88 tissue-specific elements, 26% of which did not show canonical enhancer-associated chromatin signatures in the corresponding tissues. Overall, we find these hidden enhancers are indistinguishable from marked enhancers based on levels of evolutionary conservation, enrichment of transcription factor families, and genomic positioning relative to putative target genes. In combination, our retrospective and prospective studies assessed only 0.1% of the mouse genome and identified 309 tissue-specific enhancers that are hidden from current chromatin-based enhancer identification approaches. Our findings suggest the existence of tens of thousands of active enhancers throughout the genome that remain undetected by current chromatin profiling approaches and are an unappreciated source of additional genome function of import in interpreting growing whole human genome sequencing data.

Abstract Mouse models are a critical tool for studying human diseases, particularly developmental disorders 1 . However, conventional approaches for phenotyping may fail to detect subtle defects throughout the developing mouse 2 . Here we set out to establish single-cell RNA sequencing of the whole embryo as a scalable platform for the systematic phenotyping of mouse genetic models. We applied combinatorial indexing-based single-cell RNA sequencing 3 to profile 101 embryos of 22 mutant and 4 wild-type genotypes at embryonic day 13.5, altogether profiling more than 1.6 million nuclei. The 22 mutants represent a range of anticipated phenotypic severities, from established multisystem disorders to deletions of individual regulatory regions 4,5 . We developed and applied several analytical frameworks for detecting differences in composition and/or gene expression across 52 cell types or trajectories. Some mutants exhibit changes in dozens of trajectories whereas others exhibit changes in only a few cell types. We also identify differences between widely used wild-type strains, compare phenotyping of gain- versus loss-of-function mutants and characterize deletions of topological associating domain boundaries. Notably, some changes are shared among mutants, suggesting that developmental pleiotropy might be ‘decomposable’ through further scaling of this approach. Overall, our findings show how single-cell profiling of whole embryos can enable the systematic molecular and cellular phenotypic characterization of mouse mutants with unprecedented breadth and resolution.

ABSTRACT Gene deserts are defined as genomic regions devoid of protein coding genes and spanning more than 500 kilobases, collectively encompassing about 25% of the human genome. Approximately 30% of all gene deserts are enriched for conserved elements with cis -regulatory signatures. These are located predominantly near developmental transcription factors (TFs) but despite predicted critical functions, the transcriptional contributions and biological necessity of most gene deserts remain elusive. Here, we explore the cis -regulatory impact of a gene desert flanking the Shox2 gene, a TF indispensable for proximal limb, craniofacial and cardiac pacemaker development. Using a functional genomics approach in mouse embryos we identify the gene desert as a hub for numerous Shox2 -overlapping enhancers arranged in a globular chromatin domain with tissue-specific features. In accordance, using endogenous CRISPR deletion, we demonstrate that the gene desert interval is essential for Shox2 transcriptional control in developing limbs, craniofacial compartments, and the heart. Phenotypically, gene desert ablation leads to pacemaker-related embryonic lethality due to Shox2 depletion in the cardiac sinus venosus. We show that this role is partially mediated through a distal gene desert enhancer, providing evidence for intra-gene desert regulatory robustness. Finally, we uncover a multi-layered functional role of the gene desert by revealing an additional requirement for stylopod morphogenesis, mediated through an array of proximal limb enhancers (PLEs). In summary, our study establishes the Shox2 gene desert as a fundamental genomic unit that controls pleiotropic gene expression through modular arrangement and coordinated dynamics of tissue-specific enhancers.

Abstract In mammalian embryogenesis differential gene expression gradually builds the identity and complexity of each tissue and organ system. We systematically quantified mouse polyA-RNA from embryo day E10.5 to birth, sampling 17 whole tissues, enhanced with single-cell measurements for the developing limb. The resulting developmental transcriptome is globally structured by dynamic cytodifferentiation, body-axis and cell-proliferation gene sets, characterized by their promoters’ transcription factor (TF) motif codes. We decomposed the tissue-level transcriptome using scRNA-seq and found that neurogenesis and haematopoiesis dominate at both the gene and cellular levels, jointly accounting for 1/3 of differential gene expression and over 40% of identified cell types. Integrating promoter sequence motifs with companion ENCODE epigenomic profiles identified a promoter de-repression mechanism unique to neuronal expression clusters and attributable to known and novel repressors. Focusing on the developing limb, scRNA-seq identified 25 known and candidate novel cell types, including progenitor and differentiating states with computationally inferred lineage relationships. We extracted cell type TF networks and complementary sets of candidate enhancer elements by de-convolving whole-tissue IDEAS epigenome chromatin state models. These ENCODE reference data, computed network components and IDEAS chromatin segmentations, are companion resources to the matching epigenomic developmental matrix, available for researchers to further mine and integrate.

Summary The chromatin remodeling gene CHD8 represents a central node in early neurodevelopmental gene networks implicated in autism. We examined the impact of heterozygous germline Chd8 mutation on neurodevelopment in mice. Network analysis of neurodevelopmental gene expression revealed subtle yet strongly significant widespread transcriptional changes in Chd8 +/− mice across autism-relevant networks from neurogenesis to synapse function. Chd8 +/− expression signatures included enrichment of RNA processing genes and a Chd8-regulated module featuring altered transcription of chromatin remodeling, splicing, and cell cycle genes. Chd8 +/− mice exhibited increased proliferation during brain development and neonatal increase in cortical length and volume. Structural MRI confirmed regional brain volume increase in adult Chd8 +/− mice, consistent with clinical macrocephaly. Adult Chd8 +/− mice displayed normal social interactions, and repetitive behaviors were not evident. Our results show that Chd8 +/− mice exhibit neurodevelopmental changes paralleling CHD8 +/− humans and show that Chd8 is a global genomic regulator of pathways disrupted in neurodevelopmental disorders.

The genetic basis of craniofacial birth defects and general variation in human facial shape remains poorly understood. Distant-acting transcriptional enhancers are a major category of non-coding genome function and have been shown to control the fine-tuned spatiotemporal expression of genes during critical stages of craniofacial development1-3. However, a lack of accurate maps of the genomic location and cell type-specific in vivo activities of all craniofacial enhancers prevents their systematic exploration in human genetics studies. Here, we combined histone modification and chromatin accessibility profiling from different stages of human craniofacial development with single-cell analyses of the developing mouse face to create a comprehensive catalogue of the regulatory landscape of facial development at tissue- and single cell-resolution. In total, we identified approximately 14,000 enhancers across seven developmental stages from weeks 4 through 8 of human embryonic face development. We used transgenic mouse reporter assays to determine the in vivo activity patterns of human face enhancers predicted from these data. Across 16 in vivo validated human enhancers, we observed a rich diversity of craniofacial subregions in which these enhancers are active in vivo. To annotate the cell type specificities of human-mouse conserved enhancers, we performed single-cell RNA-seq and single-nucleus ATAC-seq of mouse craniofacial tissues from embryonic days e11.5 to e15.5. By integrating these data across species, we find that the majority (56%) of human craniofacial enhancers are functionally conserved in mice, providing cell type- and embryonic stage-resolved predictions of their in vivo activity profiles. Using retrospective analysis of known craniofacial enhancers in combination with single cell-resolved transgenic reporter assays, we demonstrate the utility of these data for predicting the in vivo cell type specificity of enhancers. Taken together, our data provide an expansive resource for genetic and developmental studies of human craniofacial development.

Advances in nanopore sequencing technology have enabled investigation of the full catalogue of covalent DNA modifications. We present the first algorithm for the identification of modified nucleotides without the need for prior training data along with the open source software implementation, nanoraw. Nanoraw accurately assigns contiguous raw nanopore signal to genomic positions, enabling novel data visualization, and increasing power and accuracy for the discovery of covalently modified bases in native DNA. Ground truth case studies utilizing synthetically methylated DNA show the capacity to identify three distinct methylation marks, 4mC, 5mC, and 6mA, in seven distinct sequence contexts without any changes to the algorithm. We demonstrate quantitative reproducibility simultaneously identifying 5mC and 6mA in native E. coli across biological replicates processed in different labs. Finally we propose a pipeline for the comprehensive discovery of DNA modifications in any genome without a priori knowledge of their chemical identities.

Chromatin remodeling complexes instruct cellular differentiation and lineage specific transcription. However, the underlying mechanism is unclear. Here, using immunoprecipitation with mass spectrometry (IP-MS), we determined the dynamic composition of the BRG1/BRM associated factor (BAF) complexes during mammalian cardiac differentiation, and identified BAF60c (SMARCD3) and BAF170 (SMARCC2) as subunits enriched in cardiac precursors (CP) and cardiomyocytes (CM). The catalytic subunit Brg1 has a specific role in CPs to initiate cardiac gene expression programs and repress non-cardiac fates, a role shared by Baf60c and Baf170. In CMs, BAF60c and BAF170 are found in BRG1 and BRM-associated complexes, and are essential for maintaining the cardiac program, largely by repressing non-cardiac gene expression. BAF60c and BAF170 both modulate BAF complex composition and stoichiometry. In CM, BAF170 facilitates expulsion of a subset of BRG1-containing complexes near genes regulating post-transcriptional and epigenetic modification, as opposed to those evicted independent of BAF170 that regulate transcription, growth and development. Thus, BAF complexes use varied interdependent mechanisms to direct temporal gene expression programs in cardiogenesis.

The progressive loss of midbrain (MB) dopaminergic (DA) neurons defines the motor features of Parkinson disease (PD) and modulation of risk by common variation in PD has been well established through GWAS. Anticipating that a fraction of PD-associated genetic variation mediates their effects within this neuronal population, we acquired open chromatin signatures of purified embryonic mouse MB DA neurons. Correlation with >2,300 putative enhancers assayed in mice reveals enrichment for MB cis-regulatory elements (CRE), data reinforced by transgenic analyses of six additional sequences in zebrafish and mice. One CRE, within intron 4 of the familial PD gene SNCA, directs reporter expression in catecholaminergic neurons of transgenic mice and zebrafish. Sequencing of this CRE in 986 PD patients and 992 controls reveals two common variants associated with elevated PD risk. To assess potential mechanisms of action, we screened >20,000 DNA interacting proteins and identify a subset whose binding is impacted by these enhancer variants. Additional genotyping across the SNCA locus identifies a single PD-associated haplotype, containing the minor alleles of both of the aforementioned PD-risk variants. Our work posits a model for how common variation at SNCA may modulate PD risk and highlights the value of cell context-dependent guided searches for functional non-coding variation.