Abstract Human genetic polymorphisms result in a diversity of phenotypes. Some sequences are pathologic and lead to monogenic diseases, while others may confer beneficial traits. Genome editing is a powerful tool to recreate genotypes found in the population, including the ability to correct pathologic mutations. One of the best characterized naturally occurring mutations causing congenital erythrocytosis arises from a truncation in the erythropoietin receptor (tEPOR) which can result in non-pathogenic hyper-production of red blood cells (RBCs). Using the precision of CRISPR/Cas9 genome editing, we have recreated tEPOR and studied the effect of variations of the genotype on RBC development. We then combined tEPOR with a correction strategy developed for β-thalassemia and demonstrated that coupling the two genome editing events gave RBCs a significant selective advantage. This demonstrates the potential of combining human genetics with the precision of genome editing to enable safer and more effective genome editing therapies for patients with serious genetic diseases.

Cardiovascular diseases (CVD), and in particular cerebrovascular and ischemic heart diseases, are leading causes of death globally. Lowering circulating lipids is an important treatment strategy to reduce risk. However, some pharmaceutical mechanisms of reducing CVD may increase risk of fatty liver disease or other metabolic disorders. To identify potential novel therapeutic targets, which may reduce risk of CVD without increasing risk of metabolic disease, we focused on the simultaneous evaluation of quantitative traits related to liver function and CVD. Using a combination of low-coverage (5x) whole-genome sequencing and targeted genotyping, deep genotype imputation based on the TOPMed reference pane, and genome-wide association study (GWAS) meta-analysis, we analyzed 12 liver-related blood traits (including liver enzymes, blood lipids, and markers of iron metabolism) in up to 203,476 people from three population-based cohorts of different ancestries. We identified 88 likely causal protein-altering variants that were associated with one or more liver-related blood traits. We identified several loss-of-function (LoF) variants reducing low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) or risk of CVD without increased risk of liver disease or diabetes, including variants in known lipid genes (e.g. APOB, LPL). A novel LoF variant, ZNF529:p.K405X, was associated with decreased levels of LDL-C (P=1.3x10-8) but demonstrated no association with liver enzymes or non-fasting blood glucose levels. Silencing of ZNF529 in human hepatocytes resulted in upregulation of LDL receptor (LDLR) and increased LDL-C uptake in the cells, suggesting that inhibition of ZNF529 or its gene product could be used for treating hypercholesterolemia and hence reduce the risk of CVD. Taken together, we demonstrate that simultaneous consideration of multiple phenotypes and a focus on rare protein-altering variants may identify promising therapeutic targets.

The Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) program seeks to elucidate the genetic architecture and disease biology of heart, lung, blood, and sleep disorders, with the ultimate goal of improving diagnosis, treatment, and prevention. The initial phases of the program focus on whole genome sequencing of individuals with rich phenotypic data and diverse backgrounds. Here, we describe TOPMed goals and design as well as resources and early insights from the sequence data. The resources include a variant browser, a genotype imputation panel, and sharing of genomic and phenotypic data via dbGaP. In 53,581 TOPMed samples, >400 million single-nucleotide and insertion/deletion variants were detected by alignment with the reference genome. Additional novel variants are detectable through assembly of unmapped reads and customized analysis in highly variable loci. Among the >400 million variants detected, 97% have frequency <1% and 46% are singletons. These rare variants provide insights into mutational processes and recent human evolutionary history. The nearly complete catalog of genetic variation in TOPMed studies provides unique opportunities for exploring the contributions of rare and non-coding sequence variants to phenotypic variation. Furthermore, combining TOPMed haplotypes with modern imputation methods improves the power and extends the reach of nearly all genome-wide association studies to include variants down to ~0.01% in frequency.

Next-generation DNA sequencing is currently limited by an inability to count the number of input DNA molecules. Molecular counting is particularly needed when accurate quantification is required for diagnostic purposes, such as in single-gene non-invasive prenatal testing (sgNIPT) and liquid biopsy. We developed Quantitative Counting Template (QCT) molecular counting for reconstructing the number of input DNA molecules using sequencing data. We then used QCT molecular counting to develop sgNIPT of sickle cell disease, cystic fibrosis, spinal muscular atrophy, alpha-thalassemia, and beta-thalassemia. Incorporating molecular count information into a statistical model of disease likelihood led to analytical sensitivity and specificity of >98% and >99%, respectively. Validation of sgNIPT was further performed with maternal blood samples collected during pregnancy, and sgNIPT was 100% concordant with newborn follow-up.

ABSTRACT β-thalassemia pathology is not only due to loss of β-globin ( HBB ), but also erythrotoxic accumulation and aggregation of the β-globin binding partner, α-globin ( HBA1/2 ). Here we describe a Cas9/AAV6-mediated genome editing strategy that can replace the entire HBA1 gene with a full-length HBB transgene in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), which is sufficient to normalize β-globin:α-globin mRNA and protein ratios and restore functional adult hemoglobin tetramers in patient-derived red blood cells. Edited HSPCs were capable of long-term and bi-lineage hematopoietic reconstitution in mice, establishing proof-of-concept for replacement of HBA1 with HBB as a novel therapeutic strategy for curing β-thalassemia.

Abstract Some gene polymorphisms can lead to monogenic diseases, whereas other polymorphisms may confer beneficial traits. A well-characterized example is congenital erythrocytosis—the non-pathogenic hyper-production of red blood cells—that is caused by a truncated erythropoietin receptor. Here we show that Cas9-mediated genome editing in CD34 + human haematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) can recreate the truncated form of the erythropoietin receptor, leading to substantial increases in erythropoietic output. We also show that combining the expression of the cDNA of a truncated erythropoietin receptor with a previously reported genome-editing strategy to fully replace the HBA1 gene with an HBB transgene in HSPCs (to restore normal haemoglobin production in cells with a β-thalassaemia phenotype) gives the edited HSPCs and the healthy red blood cell phenotype a proliferative advantage. Combining knowledge of human genetics with precise genome editing to insert natural human variants into therapeutic cells may facilitate safer and more effective genome-editing therapies for patients with genetic diseases.

Abstract Presentation Date: 6/8/2024 Presentation Start Time: 6:00 PM Background Sickle cell disease (SCD), an inherited red cell disorder, generates abnormal (sickle) hemoglobin that polymerizes under hypoxic conditions. Sickle hemoglobin (HbS) polymerization produces sickled red blood cells (RBCs) and triggers vaso-occlusion and episodes of severe acute pain, also known as vaso-occlusive events (VOEs). These painful episodes are initiated by the adhesion of white blood cells (WBCs) to the endothelium via P-selectin, facilitating the binding of circulating sickle RBCs to WBCs. Subsequent polymerization of HbS within RBCs causes rigidity, leading to vessel occlusion and ischemia-induced pain. Concurrently, complement activation, a common pathogenic event in SCD, may exacerbate tissue damage and affect multiple cell types (RBCs, leukocytes, and endothelial cells), thereby also contributing to pain. Painful VOEs represent a hallmark complication of sickle cell disease (SCD) in adolescents and adults, often leading patients to seek medical care in hospital emergency departments. Despite advances in pain management, current SCD therapies lack effectiveness in modifying the course of VOE once initiated, leaving many patients with inadequate or incomplete treatment. Consequently, there is a pressing need for non-opioid-based therapeutic options that target the underlying mechanisms of VOE to provide more comprehensive pain relief and improve patient outcomes. We propose to prevent VOE pain by reducing the inciting event of WBC adhesion via P-selectin to the endothelium and reducing complement activation. IHP-102, a glycan-based therapeutic, targets multiple VOE-related mechanisms, including P-selectin and complement, and has been demonstrated to reduce pulmonary vessel occlusion in humanized SCD mice. This study aims to evaluate the analgesic efficacy of IHP-102 to reduce acute VOE-like pain behaviors in the Townes humanized SCD mouse model. Methods Acute dose-response and longitudinal studies of IHP-102 will be conducted in Townes SS (SCD) and AA (control) mice. Both male and female mice (8 weeks old) will be utilized to explore potential sex-related effects. Acute VOE will be induced by hypoxia (5-15% O2) exposure and IHP-102 (0-60 mg/kg, subcutaneous, s.c.) will be administered at onset of reoxygenation. Behavioral (pain) testing for mechanical and thermal (hot & cold) hypersensitivity, as well as grip strength will occur 2-3 hours post-injection/exposure. In a longitudinal study, IHP-102 (30 mg/kg, effective dose for preventing vaso-occlusion) or the lowest effective dose will be administered daily for two weeks, with hypoxia exposure and behavioral testing every 3 days. After the final testing, mice will be euthanized, and blood/organs collected for biomarker analysis, including an assessment of organ damage. The impact of IHP-102 on cellular adhesion to a P-selectin-lined microfluidics device will be evaluated. Data analysis will involve ANOVAs and linear mixed models, reporting regression coefficients, standard errors, and 95% confidence intervals. Results We anticipate that IHP-102 will significantly decrease acute and chronic pain behaviors in SS mice treated with IHP-102 compared to untreated controls, by reducing vaso-occlusion via P-selectin. We anticipate that targeting of complement activation will further contribute to pain reduction by mitigating tissue damage and inflammation associated with VOEs. By modulating complement-mediated pathways, we expect to observe improvements in vascular integrity and reduced leukocyte infiltration, leading to a decrease in overall ischemia-induced pain. Conclusions If successful in this pre-clinical animal model, IHP-102 will progress to human clinical trials. Conceptually, IHP is a game changing medication for SCD as current home treatment options are limited to non-specific anti-inflammatory and opioid medications. IHP-102 can be administered subcutaneously by individuals with SCD in their home, preventing further adhesion and vaso-occlusion in a disease-targeted manner, and reducing pain, opioid exposure, and need for hospitalization. Overall, we anticipate that the results of this study will provide valuable insights into the therapeutic potential of IHP-102 in alleviating acute VOE-like pain behaviors, offering a promising avenue for improving pain management and enhancing the quality of life for individuals with SCD.