Abstract One major limitation of neutralizing antibody-based COVID-19 therapy is the requirement of costly cocktails to reduce antibody resistance. We engineered two bispecific antibodies (bsAbs) using distinct designs and compared them with parental antibodies and their cocktail. Single molecules of both bsAbs block the two epitopes targeted by parental antibodies on the receptor-binding domain (RBD). However, bsAb with the IgG-(scFv) 2 design (14-H-06) but not the CrossMAb design (14-crs-06) increases antigen-binding and virus-neutralizing activities and spectrum against multiple SARS-CoV-2 variants including the Omicron, than the cocktail. X-ray crystallography and computational simulations reveal distinct neutralizing mechanisms for individual cocktail antibodies and suggest higher inter-spike crosslinking potentials by 14-H-06 than 14-crs-06. In mouse models of infections by SARS-CoV-2 and the Beta, Gamma, and Delta variants, 14-H-06 exhibits higher or equivalent therapeutic efficacy than the cocktail. Rationally engineered bsAbs represent a cost-effective alternative to antibody cocktails and a promising strategy to improve potency and breadth.

ABSTRACT Human cytomegalovirus (HCMV) encodes for multiple surface glycoproteins and glycoprotein complexes 1, 2 . One of these complexes, the HCMV Pentamer (gH, gL, UL128, UL130 and UL131), mediates tropism to both epithelial and endothelial cells by interacting with the cell surface receptor neuropilin 2 (NRP2) 3, 4 . Despite the critical nature of this interaction, the molecular determinants that govern NRP2 recognition remain unclear. Here we describe the cryo-EM structure of NRP2 bound to the HCMV Pentamer. The high-affinity interaction between these proteins is calcium-dependent and differs from the canonical C-terminal arginine (CendR) binding that NRP2 typically utilizes 5, 6 . The interaction is primarily mediated by NRP2 domains a2 and b2, which interact with UL128 and UL131. We also determine the structures of four human-derived neutralizing antibodies in complex with the HCMV Pentamer to define susceptible epitopes. The two most potent antibodies recognize a novel epitope yet do not compete with NRP2 binding. Collectively, these findings provide a structural basis for HCMV tropism and antibody-mediated neutralization, and serve as a guide for the development of HCMV treatments and vaccines.

ABSTRACT Breast tumors generally consist of a diverse population of cells with varying gene expression profiles. Breast tumor heterogeneity is a major factor contributing to drug resistance, recurrence, and metastasis after chemotherapy. Antibody-drug conjugates (ADCs) are emerging chemotherapeutic agents with striking clinical success, including T-DM1 for HER2-positive breast cancer. However, these ADCs often suffer from issues associated with intratumor heterogeneity. Here, we show that homogeneous ADCs containing two distinct payloads are a promising drug class for addressing this clinical challenge. Our conjugates show HER2-specific cell killing potency, desirable pharmacokinetic profiles, minimal immunogenicity, and marginal toxicity at therapeutic doses. Notably, a dual-drug ADC exerts greater treatment effect and survival benefit than does co-administration of two single-drug variants in a xenograft mouse model representing intratumor HER2 heterogeneity and elevated drug resistance. Our findings highlight the therapeutic potential of the dual-drug ADC format for treating refractory breast cancer and perhaps other cancers.

Abstract Recently, we discovered a new glucogenic and centrally-acting orexigenic hormone – asprosin. Asprosin is elevated in metabolic syndrome (MS) patients, and importantly, its genetic loss results in reduced appetite, leanness and robust insulin sensitivity, leading to protection from MS. Here we demonstrate that anti-asprosin monoclonal antibodies (mAbs) are a dual-effect pharmacologic therapy that targets the two key pillars of MS – over-nutrition and the blood glucose burden. Anti-asprosin mAbs from three distinct species lowered appetite and body weight, and improved blood glucose in a dose-dependent and epitope-agnostic fashion in three independent MS mouse models, with an IC 50 of ∼1.5 mg/kg. In addition, mAb treatment ameliorated MS associated dyslipidemia and hepatic dysfunction. The mAbs displayed half-life of over 3 days in vivo, with equilibrium dissociation-constants in picomolar to low nanomolar range. This evidence paves the way for further development towards an investigational new drug application and subsequent human trials for treatment of MS, a defining physical ailment of our time.

Abstract Hepatic platelet accumulation contributes to acetaminophen (APAP)-induced liver injury (AILI). However, little is known about the molecular pathways involved in platelet recruitment to the liver and whether targeting such pathways could attenuate AILI. The present study unveiled a critical role of chitinase 3-like-1 (Chi3l1) in hepatic platelet recruitment during AILI. Increased Chi3l1 and platelets in the liver were observed in patients and mice overdosed with APAP. Compared to wild-type (WT) mice, Chi3l1 -/- mice developed attenuated AILI with markedly reduced hepatic platelet accumulation. Mechanistic studies revealed that Chi3l1 signaled through CD44 on macrophages to induce podoplanin expression, which mediated platelet recruitment through C-type lectin-like receptor 2. Moreover, APAP treatment of CD44 -/- mice resulted in much lower numbers of hepatic platelets and liver injury than WT mice, a phenotype similar to that in Chi3l1 -/- mice. Recombinant Chi3l1 could restore hepatic platelet accumulation and AILI in Chi3l1 -/- mice, but not in CD44 -/- mice. Importantly, we generated anti-Chi3l1 monoclonal antibodies and demonstrated that they could effectively inhibit hepatic platelet accumulation and AILI. Overall, we uncovered the Chi3l1/CD44 axis as a critical pathway mediating APAP-induced hepatic platelet recruitment and tissue injury. We demonstrated the feasibility and potential of targeting Chi3l1 to treat AILI.

Abstract The capacity of SARS-CoV-2 to evolve poses challenges to conventional prevention and treatment options such as vaccination and monoclonal antibodies, as they rely on viral receptor binding domain (RBD) sequences from previous strains. Additionally, animal CoVs, especially those of the SARS family, are now appreciated as a constant pandemic threat. We present here a new antiviral approach featuring inhalation delivery of a recombinant viral trap composed of ten copies of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) fused to the IgM Fc. This ACE2 decamer viral trap is designed to inhibit SARS-CoV-2 entry function, regardless of viral RBD sequence variations as shown by its high neutralization potency against all known SARS-CoV-2 variants, including Omicron BQ.1, BQ.1.1, XBB.1 and XBB.1.5. In addition, it demonstrates potency against SARS-CoV-1, human NL63, as well as bat and pangolin CoVs. The multivalent trap is effective in both prophylactic and therapeutic settings since a single intranasal dosing confers protection in human ACE2 transgenic mice against viral challenges. Lastly, this molecule is stable at ambient temperature for more than twelve weeks and can sustain physical stress from aerosolization. These results demonstrate the potential of a decameric ACE2 viral trap as an inhalation solution for ACE2-dependent coronaviruses of current and future pandemic concerns.

We report the engineering and selection of two synthetic proteins - FSR16m and FSR22 - for possible treatment of SARS-CoV-2 infection. FSR16m and FSR22 are trimeric proteins composed of DARPin SR16m or SR22 fused with a T4 foldon and exhibit broad spectrum neutralization of SARS-Cov-2 strains. The IC 50 values of FSR16m against authentic B.1.351, B.1.617.2 and BA.1.1 variants are 3.4 ng/mL, 2.2 ng/mL and 7.4 ng/mL, respectively, comparable to currently used therapeutic antibodies. Despite the use of the spike protein from a now historical wild-type virus for design, FSR16m and FSR22 both exhibit increased neutralization against newly-emerged variants of concern (39- to 296-fold) in pseudovirus assays. Cryo-EM structures revealed that these DARPins recognize a region of the receptor binding domain (RBD, residues 455-456, 486-489) overlapping a critical portion of the ACE2-binding surface. K18-hACE2 transgenic mice inoculated with a B.1.617.2 variant and receiving intranasally-administered FSR16m were protected as judged by less weight loss and 10-100-fold reductions in viral burden in the upper and lower respiratory tracts. The strong and broad neutralization potency make FSR16m and FSR22 promising candidates for prevention and treatment of infection by current and potential future strains of SARS-CoV-2.

Abstract Human cytomegalovirus (HCMV) remains the most common congenital infection and infectious complication in immunocompromised patients. The most successful HCMV vaccine to-date, an HCMV glycoprotein B (gB) subunit vaccine adjuvanted with MF59, achieved 50% efficacy against primary HCMV infection. A previous study demonstrated that gB/MF59 vaccinees were less frequently infected with HCMV gB genotype strains most similar to the vaccine strain than strains encoding genetically distinct gB genotypes, suggesting strain-specific immunity accounted for the limited efficacy. To determine whether vaccination with multiple HCMV gB genotypes could increase the breadth of anti-HCMV gB humoral and cellular responses, we immunized 18 female rabbits with monovalent (gB-1), bivalent (gB-1+gB-3), or pentavalent (gB-1+gB-2+gB-3+gB-4+gB-5) gB lipid nanoparticle-encapsulated nucleoside-modified RNA (mRNA-LNP) vaccines. The multivalent vaccine groups did not demonstrate higher magnitude or breadth of the IgG response to the gB ectodomain or cell-associated gB compared to that of monovalent vaccine. Also, the multivalent vaccines did not show an increase in the breadth of neutralization activity and antibody-dependent cellular phagocytosis against HCMV strains encoding distinct gB genotypes. Yet, peripheral blood mononuclear cell-derived T cell responses elicited by multivalent vaccines were of a higher magnitude compared to that of monovalent vaccinated animals against a vaccine-mismatched gB genotype at peak immunogenicity. Our data suggests that inclusion of multivalent gB antigens is beneficial to increase the magnitude of T cell response but not an effective strategy to increase the breadth of anti-HCMV gB antibody responses. Further studies are required to validate whether the multivalent gB mRNA vaccines could effectively increase the T cell response breadth.

Human cytomegalovirus (HCMV) is the most common congenital infection, and the leading nongenetic cause of sensorineural hearing loss (SNHL) in newborns globally. A gB subunit vaccine administered with adjuvent MF59 (gB/MF59) is the most efficacious tested to-date, achieving 50% efficacy in preventing infection of HCMV-seronegative mothers. We recently discovered that gB/MF59 vaccination elicited primarily non-neutralizing antibody responses, that HCMV strains acquired by vaccinees more often included strains with gB genotypes that are distinct from the vaccine antigen, and that protection against HCMV acquisition correlated with ability of vaccine-elicited antibodies to bind to membrane associated gB. Thus, we hypothesized that gB-specific non-neutralizing antibody binding breadth and function are dependent on their epitope and genotype specificity as well as their ability to interact with membrane-associated gB. Twenty-four gB-specific monoclonal antibodies (mAbs) isolated from naturally HCMV-infected individuals were mapped for gB domain specificity by binding antibody multiplex assay (BAMA) and for genotype preference binding to membrane-associated gB presented on transfected cells. We defined their non-neutralizing functions including antibody dependent cellular phagocytosis (ADCP) and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC). The isolated gB-specific non-neutralizing mAbs were primarily specific for Domain II and linear antigenic domain 2 site 2 (AD2). We observed variability in mAb gB genotype binding preference, with increased binding to gB genotypes 2 and 4. Functional studies identified two gB-specific mAbs that facilitate ADCP and have binding specificities of AD2 and Domain II. This investigation provides novel understanding on the impact of gB domain specificity and antigenic variability on gB-specific non-neutralizing antibody responses.

SARS-CoV-2 Delta variant has rapidly replaced the Alpha variant around the world. The mechanism that drives this global replacement has not been defined. Here we report that Delta spike mutation P681R plays a key role in the Alpha-to-Delta variant replacement. In a replication competition assay, Delta SARS-CoV-2 efficiently outcompeted the Alpha variant in human lung epithelial cells and primary human airway tissues. Delta SARS-CoV-2 bearing the Alpha-spike glycoprotein replicated less efficiently than the wild-type Delta variant, suggesting the importance of Delta spike in enhancing viral replication. The Delta spike has accumulated mutation P681R located at a furin cleavage site that separates the spike 1 (S1) and S2 subunits. Reverting the P681R mutation to wild-type P681 significantly reduced the replication of Delta variant, to a level lower than the Alpha variant. Mechanistically, the Delta P681R mutation enhanced the cleavage of the full-length spike to S1 and S2, leading to increased infection via cell surface entry. In contrast, the Alpha spike also has a mutation at the same amino acid (P681H), but the spike cleavage from purified Alpha virions was reduced compared to the Delta spike. Collectively, our results indicate P681R as a key mutation in enhancing Delta variant replication via increased S1/S2 cleavage. Spike mutations that potentially affect furin cleavage efficiency must be closely monitored for future variant surveillance.