ABSTRACT In common with other omics technologies, mass spectrometry (MS)-based proteomics produces ever-increasing amounts of raw data, making their efficient analysis a principal challenge. There is a plethora of different computational tools that process the raw MS data and derive peptide and protein identification and quantification. During the last decade, there has been dramatic progress in computer science and software engineering, including collaboration tools that have transformed research and industry. To leverage these advances, we developed AlphaPept, a Python-based open-source framework for efficient processing of large high-resolution MS data sets. Using Numba for just-in-time machine code compilation on CPU and GPU, we achieve hundred-fold speed improvements while maintaining clear syntax and rapid development speed. AlphaPept uses the Python scientific stack of highly optimized packages, reducing the code base to domain-specific tasks while providing access to the latest advances in machine learning. We provide an easy on-ramp for community validation and contributions through the concept of literate programming, implemented in Jupyter Notebooks of the different modules. A framework for continuous integration, testing, and benchmarking enforces solid software engineering principles. Large datasets can rapidly be processed as shown by the analysis of hundreds of cellular proteomes in minutes per file, many-fold faster than the data acquisiton. The AlphaPept framework can be used to build automated processing pipelines using efficient HDF5 based file formats, web-serving functionality and compatibility with downstream analysis tools. Easy access for end-users is provided by one-click installation of the graphical user interface, for advanced users via a modular Python library, and for developers via a fully open GitHub repository.

Abstract Single-cell proteomics aims to characterize biological function and heterogeneity at the level of proteins in an unbiased manner. It is currently limited in proteomic depth, throughput and robustness, a challenge that we address here by a streamlined multiplexed workflow using data-independent acquisition (mDIA). We demonstrate automated and complete dimethyl labeling of bulk or single-cell samples, without losing proteomic depth. In single runs of mammalian cells, a three-plex analysis of tryptic peptides quantified 7,700 proteins per channel. The Lys-N enzyme enables five-plex quantification at MS1 and MS2 level. Because the multiplex channels are quantitatively isolated from each other, mDIA accommodates a reference channel that does not interfere with the target channels. Our algorithm RefQuant takes advantage of this feature and confidently quantifies close to 4,000 proteins in single cells with excellent reproducibility, while our workflow currently allows routine analysis of 80 single cells per day. The concept of a stable proteome still holds at this deeper proteome coverage.

Abstract Elucidating the wiring diagram of the human cell is a central goal of the post-genomic era. We combined genome engineering, confocal live-cell imaging, mass spectrometry and data science to systematically map the localization and interactions of human proteins. Our approach provides a data-driven description of the molecular and spatial networks that organize the proteome. Unsupervised clustering of these networks delineates functional communities that facilitate biological discovery, and uncovers that RNA-binding proteins form a specific sub-group defined by unique interaction and localization properties. Furthermore, we discover that remarkably precise functional information can be derived from protein localization patterns, which often contain enough information to identify molecular interactions. Paired with a fully interactive website opencell.czbiohub.org, we provide a resource for the quantitative cartography of human cellular organization.

Abstract Single-cell proteomics by mass spectrometry (MS) is emerging as a powerful and unbiased method for the characterization of biological heterogeneity. So far, it has been limited to cultured cells, whereas an expansion of the method to complex tissues would greatly enhance biological insights. Here we describe single-cell Deep Visual Proteomics (scDVP), a technology that integrates high-content imaging, laser microdissection and multiplexed MS. scDVP resolves the context-dependent, spatial proteome of murine hepatocytes at a current depth of 1,700 proteins from a slice of a cell. Half of the proteome was differentially regulated in a spatial manner, with protein levels changing dramatically in proximity to the central vein. We applied machine learning to proteome classes and images, which subsequently inferred the spatial proteome from imaging data alone. scDVP is applicable to healthy and diseased tissues and complements other spatial proteomics or spatial omics technologies.

ABSTRACT Data-independent acquisition (DIA) methods have become increasingly attractive in mass spectrometry (MS)-based proteomics, because they enable high data completeness and a wide dynamic range. Recently, we combined DIA with parallel accumulation – serial fragmentation (dia-PASEF) on a Bruker trapped ion mobility separated (TIMS) quadrupole time-of-flight (TOF) mass spectrometer. This requires alignment of the ion mobility separation with the downstream mass selective quadrupole, leading to a more complex scheme for dia-PASEF window placement compared to DIA. To achieve high data completeness and deep proteome coverage, here we employ variable isolation windows that are placed optimally depending on precursor density in the m/z and ion mobility plane. This A utomatic Isolation D esign procedure is implemented in the freely available py_diAID package. In combination with in-depth project-specific proteomics libraries and the Evosep LC system, we reproducibly identified over 7,700 proteins in a human cancer cell line in 44 minutes with quadruplicate single-shot injections at high sensitivity. Even at a throughput of 100 samples per day (11 minutes LC gradients), we consistently quantified more than 6,000 proteins in mammalian cell lysates by injecting four replicates. We found that optimal dia-PASEF window placement facilitates in-depth phosphoproteomics with very high sensitivity, quantifying more than 35,000 phosphosites in a human cancer cell line stimulated with an epidermal growth factor (EGF) in triplicate 21 minutes runs. This covers a substantial part of the regulated phosphoproteome with high sensitivity, opening up for extensive systems-biological studies.

Abstract Existing tests for detecting liver fibrosis, inflammation and steatosis, three stages of liver disease that are still reversible are severely hampered by limited accuracy or invasive nature. Here, we present a paired liver-plasma proteomics approach to infer molecular pathophysiology and to identify biomarkers in a cross-sectional alcohol-related liver disease cohort of nearly 600 individuals. Metabolic functions were downregulated whereas fibrosis-associated signaling and novel immune responses were upregulated, but only half of tissue proteome changes were transmitted to the circulation. Machine learning models based on our biomarker panels outperformed existing tests, laying the foundation for a generic proteomic liver health assessment.

ABSTRACT Although current mass spectrometry (MS)-based proteomics identifies and quantifies thousands of proteins and (modified) peptides, only a minority of them are subjected to in-depth downstream analysis. With the advent of automated processing workflows, biologically or clinically important results within a study are rarely validated by visualization of the underlying raw information. Current tools are often not integrated into the overall analysis nor readily extendable with new approaches. To remedy this, we developed AlphaViz, an open-source Python package to superimpose output from common analysis workflows on the raw data for easy visualization and validation of protein and peptide identifications. AlphaViz takes advantage of recent breakthroughs in the deep learning-assisted prediction of experimental peptide properties to allow manual assessment of the expected versus measured peptide result. We focused on the visualization of the 4-dimensional data cuboid provided by Bruker TimsTOF instruments, where the ion mobility dimension, besides intensity and retention time, can be predicted and used for verification. We illustrate how AlphaViz can quickly validate or invalidate peptide identifications regardless of the score given to them by automated workflows. Furthermore, we provide a ‘predict mode’ that can locate peptides present in the raw data but not reported by the search engine. This is illustrated the recovery of missing values from experimental replicates. Applied to phosphoproteomics, we show how key signaling nodes can be validated to enhance confidence for downstream interpretation or follow-up experiments. AlphaViz follows standards for open-source software development and features an easy-to-install graphical user interface for end-users and a modular Python package for bioinformaticians. Validation of critical proteomics results should now become a standard feature in MS-based proteomics.

Abstract Ploidy changes are frequent in nature and contribute to evolution, functional specialization and tumorigenesis (1,2). Analysis of model organisms of different ploidies revealed that increased ploidy leads to an increase in cell and nuclear volume, reduced proliferation (2-4), metabolic changes (5), lower fitness (6,7), and increased genomic instability (8,9), but the underlying mechanisms remain poorly understood. To investigate how the gene expression changes with cellular ploidy, we analyzed isogenic series of budding yeasts from 1N to 4N. We show that mRNA and protein abundance scales allometrically with ploidy, with tetraploid cells showing only threefold increase in proteins compared to haploids. This ploidy-specific scaling occurs via decreased rRNA and ribosomal protein abundance and reduced translation. We demonstrate that the Tor1 activity is reduced with increasing ploidy, which leads to rRNA gene repression via a novel Tor1-Sch9-Tup1 signaling pathway. mTORC1 and S6K activity are also reduced in human tetraploid cells and the concomitant increase of the Tup1 homolog Tle1 downregulates the rDNA transcription. Our results revealed a novel conserved mTORC1-S6K-Tup1/Tle1 pathway that ensures proteome remodeling in response to increased ploidy.

Aging promotes lung function decline and susceptibility to chronic lung diseases, which are the third leading cause of death worldwide. We used single cell transcriptomics and mass spectrometry to quantify changes in cellular activity states of 30 cell types and the tissue proteome from lungs of young and old mice. Aging led to increased transcriptional noise, indicating deregulated epigenetic control. We observed highly distinct effects of aging on cell type level, uncovering increased cholesterol biosynthesis in type-2 pneumocytes and lipofibroblasts as a novel hallmark of lung aging. Proteomic profiling revealed extracellular matrix remodeling in old mice, including increased collagen IV and XVI and decreased Fraser syndrome complex proteins and Collagen XIV. Computational integration of the aging proteome and single cell transcriptomes predicted the cellular source of regulated proteins and created a first unbiased reference of the aging lung. The lung aging atlas can be accessed via an interactive user-friendly webtool at: https://theislab.github.io/LungAgingAtlas