Summary Animal bodies are composed of hundreds of cell types that differ in location, morphology, cytoarchitecture, and physiology. This is reflected by cell type-specific transcription factors and downstream effector genes implementing functional specialisation. Here, we establish and explore the link between cell type-specific gene expression and subcellular morphology for the entire body of the marine annelid Platynereis dumerilii . For this, we registered a whole-body cellular expression atlas to a high-resolution electron microscopy dataset, automatically segmented all cell somata and nuclei, and clustered the cells according to gene expression or morphological parameters. We show that collective gene expression most efficiently identifies spatially coherent groups of cells that match anatomical boundaries, which indicates that combinations of regionally expressed transcription factors specify tissue identity. We provide an integrated browser as a Fiji plugin to readily explore, analyse and visualise multimodal datasets with remote on-demand access to all available datasets.

Abstract Serial section transmission electron microscopy (TEM) has proven to be one of the leading methods for millimeter-scale 3D imaging of brain tissues at nanoscale resolution. It is important to further improve imaging efficiency to acquire larger and more brain volumes. We report here a three fold increase in the speed of TEM by using a beam deflecting mechanism to enable highly efficient acquisition of multiple image tiles (nine) for each motion of the mechanical stage. For millimeter-scale areas, the duty cycle of imaging doubles to more than 30%, yielding a net average imaging rate of 0.3 gigapixels per second. If fully utilized, an array of beam deflection TEMs should be capable of imaging a dataset of cubic millimeter scale in several weeks.

Abstract Electron microscopy of biological tissue has recently seen an unprecedented increase in imaging throughput moving the ultrastructural analysis of large tissue blocks such as whole brains into the realm of the feasible. However, homogeneous, high quality electron microscopy staining of large biological samples is still a major challenge. To date, assessing the staining quality in electron microscopy requires running a sample through the entire staining protocol end-to-end, which can take weeks or even months for large samples, rendering protocol optimization for such samples to be inefficient. Here we present an in situ time-lapsed X-ray assisted staining procedure that opens the “black box” of electron microscopy staining and allows observation of individual staining steps in real time. Using this novel method we measured the accumulation of heavy metals in large tissue samples immersed in different staining solutions. We show that the measured accumulation of osmium in fixed tissue obeys empirically a quadratic dependence between the incubation time and sample size. We found that potassium ferrocyanide, a classic reducing agent for osmium tetroxide, clears the tissue after osmium staining and that the tissue expands in osmium tetroxide solution, but shrinks in reduced osmium solution. X-ray assisted staining gave access to the in situ staining kinetics and allowed us to develop a diffusion-reaction-advection model that accurately simulates the measured accumulation of osmium in tissue. These are first steps towards in silico staining experiments and simulation-guided optimization of staining protocols for large samples. Hence, X-ray assisted staining will be a useful tool for the development of reliable staining procedures for large samples such as entire brains of mice, monkeys or humans.

The map of synaptic connectivity among neurons in the brain shapes the computations that neural circuits may perform. Inferring the design principles of neural connectomes is, therefore, fundamental for understanding brain development and architecture, neural computations, learning, and behavior. Here, we learn probabilistic generative models for the connectomes of the olfactory bulb of zebrafish, part of the mouse visual cortex, and of C. elegans . We show that, in all cases, models that rely on a surprisingly small number of simple biological and physical features are highly accurate in replicating a wide range of properties of the measured circuits. Specifically, they accurately predict the existence of individual synapses and their strength, distributions of synaptic indegree and outdegree of the neurons, frequency of sub-network motifs, and more. Furthermore, we simulate synthetic circuits generated by our model for the olfactory bulb of zebrafish and show that they replicate the computation that the real circuit performs in response to olfactory cues. Finally, we show that specific failures of our models reflect missing design features that we uncover by adding latent features to the model. Thus, our results reflect surprisingly simple design principles of real connectomes in three different systems and species, and offer a novel general computational framework for analyzing connectomes and linking structure and function in neural circuits.

The mammalian brain is composed of diverse neuron types that play different functional roles. Recent single-cell RNA sequencing approaches have led to a whole brain taxonomy of transcriptomically-defined cell types, yet cell type definitions that include multiple cellular properties can offer additional insights into a neuron's role in brain circuits. While the Patch-seq method can investigate how transcriptomic properties relate to the local morphological and electrophysiological properties of cell types, linking transcriptomic identities to long-range projections is a major unresolved challenge. To address this, we collected coordinated Patch-seq and whole brain morphology data sets of excitatory neurons in mouse visual cortex. From the Patch-seq data, we defined 16 integrated morpho-electric-transcriptomic (MET)-types; in parallel, we reconstructed the complete morphologies of 300 neurons. We unified the two data sets with a multi-step classifier, to integrate cell type assignments and interrogate cross-modality relationships. We find that transcriptomic variations within and across MET-types correspond with morphological and electrophysiological phenotypes. In addition, this variation, along with the anatomical location of the cell, can be used to predict the projection targets of individual neurons. We also shed new light on infragranular cell types and circuits, including cell-type-specific, interhemispheric projections. With this approach, we establish a comprehensive, integrated taxonomy of excitatory neuron types in mouse visual cortex and create a system for integrated, high-dimensional cell type classification that can be extended to the whole brain and potentially across species.

Abstract To understand the brain we must relate neurons’ functional responses to the circuit architecture that shapes them. Here, we present a large functional connectomics dataset with dense calcium imaging of a millimeter scale volume. We recorded activity from approximately 75,000 neurons in primary visual cortex (VISp) and three higher visual areas (VISrl, VISal and VISlm) in an awake mouse viewing natural movies and synthetic stimuli. The functional data were co-registered with a volumetric electron microscopy (EM) reconstruction containing more than 200,000 cells and 0.5 billion synapses. Subsequent proofreading of a subset of neurons in this volume yielded reconstructions that include complete dendritic trees as well the local and inter-areal axonal projections that map up to thousands of cell-to-cell connections per neuron. Here, we release this dataset as an open-access resource to the scientific community including a set of tools that facilitate data retrieval and downstream analysis. In accompanying papers we describe our findings using the dataset to provide a comprehensive structural characterization of cortical cell types 1–3 and the most detailed synaptic level connectivity diagram of a cortical column to date 2 , uncovering unique cell-type specific inhibitory motifs that can be linked to gene expression data 4 . Functionally, we identify new computational principles of how information is integrated across visual space 5 , characterize novel types of neuronal invariances 6 and bring structure and function together to decipher a general principle that wires excitatory neurons within and across areas 7, 8 .

Abstract Recent clinical observations highlight the importance of the spatial organization of immune cells into lymphoid structures for the success of cancer immunotherapy and patient survival. Sequential chromogenic immunohistochemistry (scIHC) supports the analysis of multiple biomarkers on a single tissue section thus providing unique information about relative location of cell types and assessment of disease states. Unfortunately, widespread implementation of scIHC is limited by lack of a standardized, rigorous guide to the development of customized biomarker panels and by the need for user-friendly analysis pipelines able to streamline the extraction of meaningful data. Here, we examine major steps from classical IHC protocols and highlight the impact they have on the scIHC procedure. We report practical examples and illustrations of the most common complications that can arise during the setup of a new biomarker panel and how to avoid them. We described in detail how to prevent and detect cross- reactivity between secondary reagents and carry over between detection antibodies. We developed a novel analysis pipeline based on non-rigid tissue deformation correction, Cellpose-inspired automated cell segmentation and computational network masking of low-quality data. The resulting biomarker panel and pipeline was used to study regional lymph nodes from head and neck cancer patients. We identified contact interactions between plasmablasts and plasmacytoid dendritic cells in vivo . Given that TLR receptors, which are highly expressed in plasmacytoid dendritic cells play a key role in vaccine efficacy, the significance of this cell-cell interaction decisively warrants further studies. In conclusion, this work streamlines the development of novel biomarker panels for scIHC, which will ultimately improve our understanding of immune responses in cancer.

Wiring diagrams of neural circuits are of central importance in delineating mechanisms of computation in the brain (Lichtman and Sanes, 2008; Litwin-Kumar and Turaga, 2019). To generate these diagrams, the individual parts of neurons - axons, dendrites and synapses - must be densely identified in 3-dimensional volumes of neuronal tissue. This is typically achieved by electron microscopy (Kornfeld and Denk, 2018), necessitating physical sectioning of the specimen either before or during the image acquisition process using ultrathin sectioning techniques or gallium or gas cluster ion beams (Denk and Horstmann, 2004; Hayworth et al., 2020; Kasthuri et al., 2015; Xu et al., 2017). Here, we demonstrate that X-ray ptychography (Pfeiffer, 2018), a coherent diffractive X-ray imaging technique, can faithfully acquire 3-dimensional images of metal-stained mouse neuronal tissue. Achieving high imaging quality requires minimization of the radiation damage to the sample, which we achieve by imaging at cryogenic temperatures and using specialised tomographic reconstruction algorithms (Odstrcil et al., 2019b). Using a newly identified tri-functional epoxy resin we demonstrate radiation resistance to X-ray doses exceeding 1011 Gy. Sub-40 nm resolution makes it possible to densely resolve axon bundles, boutons, dendrites, and synapses without physical sectioning. Moreover, the tissue volumes can subsequently be imaged in 3D using high-resolution focused ion beam scanning electron microscopy (FIB-SEM) (Heymann et al., 2006; Knott et al., 2008) showing intact ultrastructure, suggesting that metal-stained neuronal tissue can be highly radiation-stable. Ongoing improvements in synchrotron, X-ray and detector physics (Yabashi and Tanaka, 2017), as well as further optimization of sample preparation and staining procedures (Hua et al., 2015; Karlupia et al., 2023; Lu et al., 2023; Mikula and Denk, 2015; Pallotto et al., 2015; Song et al., 2022), could lead to substantial improvements in acquisition speed (Du et al., 2021), whilst widening the volumes that can be imaged with X-ray techniques using laminography (Helfen et al., 2005; Helfen et al., 2013; Holler et al., 2020b; Holler et al., 2019) and nano-holotomography (Cloetens et al., 1999; Kuan et al., 2020) could allow for non-destructive X-ray imaging of synapses and neural circuits contained in volumes of increasing size.

Serial section transmission electron microscopy (TEM) has proven to be one of the leading methods for millimeter-scale 3D imaging of brain tissues at nanoscale resolution. It is important to further improve imaging efficiency to acquire larger and more brain volumes. We report here a threefold increase in the speed of TEM by using a beam deflecting mechanism to enable highly efficient acquisition of multiple image tiles (nine) for each motion of the mechanical stage. For millimeter-scale areas, the duty cycle of imaging doubles to more than 30%, yielding a net average imaging rate of 0.3 gigapixels per second. If fully utilized, an array of four beam deflection TEMs should be capable of imaging a dataset of cubic millimeter scale in five weeks.