ABSTRACT The ongoing SARS-CoV-2 pandemic continues to be a significant threat to global health. First reported in November 2021, the Omicron variant (B.1.1.529) is more transmissible and can evade immunity better than previous SARS-CoV-2 variants, fueling an unprecedented surge in cases. To produce functional proteins from this polyprotein, SARS-CoV-2 relies on the cysteine proteases Nsp3/papain-like protease (PLpro) and Nsp5/Main Protease (M pro )/3C-like protease to cleave at three and more than 11 sites, respectively. 1 Therefore, M pro and PL pro inhibitors are considered to be some of the most promising SARS-CoV-2 antivirals. On December 22, 2021, the Food and Drug Administration (FDA) issued an Emergency Use Authorization (EUA) for PAXLOVID, a ritonavir-boosted formulation of nirmatrelvir. Nirmatrelvir is a first-in-class orally bioavailable SARS-CoV-2 M pro inhibitor. 2 Thus, the scientific community must vigilantly monitor potential mechanisms of drug resistance, especially because SARS-CoV-2 is naïve to M pro inhibitors. Mutations have been well identified in variants to this point. 3 Notably, Omicron M pro (OM pro ) harbors a single mutation– P132H. In this study we characterize the enzymatic activity, drug inhibition, and structure of OM pro while evaluating the past and future implications of M pro mutations.

Abstract β-Lactam antibiotics, particularly cephalosporins, are major risk factors for C. difficile infection (CDI), the most common hospital acquired infection. These broad-spectrum antibiotics irreversibly inhibit penicillin-binding proteins (PBPs), essential enzymes that assemble the bacterial cell wall. Little is known about the C. difficile PBPs, yet they play central roles in the growth, infection, and transmission of this pathogen. In this study we discover that PBP2, essential for vegetative growth, is the primary bactericidal target for β-lactams in C. difficile . We further demonstrate PBP2 is insensitive to cephalosporin inhibition, revealing a key cause of the well-documented, but poorly understood, cephalosporin resistance in C. difficile . For the first time, we determine the crystal structures of C. difficile PBP2, which bears several highly unique features, including significant ligand-induced conformational changes and an active site Zn 2+ -binding motif that influences β-lactam binding and protein stability. Remarkably, this motif is shared in two other C. difficile PBPs essential for sporulation, PBP3 and SpoVD. While these PBPs are present in a wide range of bacterial taxa, including species in extreme environments and the human gut, they are mostly found in anaerobes, typically Firmicutes. The widespread presence of this convergently evolved thiol-containing motif and its cognate Zn 2+ suggests it may function as a redox-sensor to regulate cell wall synthesis for survival in adverse environments. Collectively, our findings address important etiological questions surrounding C. difficile , characterize new elements of PBP structure and function, and lay the groundwork for antibiotic development targeting both C. difficile growth and sporulation.

The SARS-CoV-2 main protease (M pro ) is the drug target of Pfizer’s oral drug Paxlovid. The emergence of SARS-CoV-2 variants with mutations in M pro raised the alarm of potential drug resistance. In this study, we identified 100 naturally occurring M pro mutations located at the nirmatrelvir binding site, among which 20 mutants, including S144M/F/A/G/Y, M165T, E166G, H172Q/F, and Q192T/S/L/A/I/P/H/V/W/C/F, showed comparable enzymatic activity to the wild-type (k cat /K m <10-fold change) and resistance to nirmatrelvir (K i >10-fold increase). X-ray crystal structures were determined for seven representative mutants with and/or without GC-376/nirmatrelvir. Viral growth assay showed that M pro mutants with reduced enzymatic activity led to attenuated viral replication. Overall, our study identified several drug resistant hot spots that warrant close monitoring for possible clinical evidence of Paxlovid resistance.Paxlovid resistant SARS-CoV-2 viruses with mutations in the main protease have been identified from clinical isolates.