Naturally occurring, pharmacologically active peptides constrained with covalent crosslinks generally have shapes that have evolved to fit precisely into binding pockets on their targets. Such peptides can have excellent pharmaceutical properties, combining the stability and tissue penetration of small-molecule drugs with the specificity of much larger protein therapeutics. The ability to design constrained peptides with precisely specified tertiary structures would enable the design of shape-complementary inhibitors of arbitrary targets. Here we describe the development of computational methods for accurate de novo design of conformationally restricted peptides, and the use of these methods to design 18–47 residue, disulfide-crosslinked peptides, a subset of which are heterochiral and/or N–C backbone-cyclized. Both genetically encodable and non-canonical peptides are exceptionally stable to thermal and chemical denaturation, and 12 experimentally determined X-ray and NMR structures are nearly identical to the computational design models. The computational design methods and stable scaffolds presented here provide the basis for development of a new generation of peptide-based drugs. Computational methods for the de novo design of conformationally restricted peptides produce exceptionally stable short peptides stabilized by backbone cyclization and/or internal disulfide bonds that are promising starting points for a new generation of peptide-based drugs. Natural peptides constrained with covalent crosslinks—intermediate in size between proteins and small molecules—can be especially potent, pharmacologically active compounds. Their shapes have evolved to fit precisely into the binding pockets on their targets. David Baker and colleagues present computational methods for the de novo design of such conformationally restricted peptides with different shapes, and use the methods to produce short peptide motifs stabilized by backbone cyclization and/or internal disulfide bonds that are shown to be exceptionally stable. The computational design methods and stable scaffolds generated provide a promising starting point for the development of a new generation of peptide-based drugs.

Glutamate transporters regulate excitatory neurotransmission and prevent glutamate-mediated excitotoxicity in the CNS. To better study the cellular and temporal dynamics of the expression of these transporters, we generated bacterial artificial chromosome promoter Discosoma red [glutamate-aspartate transporter (GLAST)] and green fluorescent protein [glutamate transporter-1 (GLT-1)] reporter transgenic mice. Analysis of these mice revealed a differential activation of the transporter promoters not previously appreciated. GLT-1 promoter activity in the adult CNS is almost completely restricted to astrocytes, often and unexpectedly in a nonoverlapping pattern with GLAST. Spinal cord GLT-1 promoter reporter, protein density, and physiology were 10-fold lower than in brain, suggesting a possible mechanism for regional sensitivity seen in disease. The GLAST promoter is active in both radial glia and many astrocytes in the developing CNS but is downregulated in most astrocytes as the mice mature. In the adult CNS, the highest GLAST promoter activity was observed in radial glia, such as those located in the subgranular layer of the dentate gyrus. The continued expression of GLAST by these neural progenitors raises the possibility that GLAST may have an unanticipated role in regulating their behavior. In addition, GLAST promoter activation was observed in oligodendrocytes in white matter throughout many (e.g., spinal cord and corpus callosum), but not all (e.g., cerebellum), CNS fiber tracts. Overall, these studies of GLT-1 and GLAST promoter activity, protein expression, and glutamate uptake revealed a close correlation between transgenic reporter signals and uptake capacity, indicating that these mice provide the means to monitor the expression and regulation of glutamate transporters in situ.

Machine learning solves RNA puzzles RNA molecules fold into complex three-dimensional shapes that are difficult to determine experimentally or predict computationally. Understanding these structures may aid in the discovery of drugs for currently untreatable diseases. Townshend et al . introduced a machine-learning method that significantly improves prediction of RNA structures (see the Perspective by Weeks). Most other recent advances in deep learning have required a tremendous amount of data for training. The fact that this method succeeds given very little training data suggests that related methods could address unsolved problems in many fields where data are scarce. —DJ

The preferred timing of umbilical-cord clamping in preterm infants is unclear.We randomly assigned fetuses from women who were expected to deliver before 30 weeks of gestation to either immediate clamping of the umbilical cord (≤10 seconds after delivery) or delayed clamping (≥60 seconds after delivery). The primary composite outcome was death or major morbidity (defined as severe brain injury on postnatal ultrasonography, severe retinopathy of prematurity, necrotizing enterocolitis, or late-onset sepsis) by 36 weeks of postmenstrual age. Analyses were performed on an intention-to-treat basis, accounting for multiple births.Of 1634 fetuses that underwent randomization, 1566 were born alive before 30 weeks of gestation; of these, 782 were assigned to immediate cord clamping and 784 to delayed cord clamping. The median time between delivery and cord clamping was 5 seconds and 60 seconds in the respective groups. Complete data on the primary outcome were available for 1497 infants (95.6%). There was no significant difference in the incidence of the primary outcome between infants assigned to delayed clamping (37.0%) and those assigned to immediate clamping (37.2%) (relative risk, 1.00; 95% confidence interval, 0.88 to 1.13; P=0.96). The mortality was 6.4% in the delayed-clamping group and 9.0% in the immediate-clamping group (P=0.03 in unadjusted analyses; P=0.39 after post hoc adjustment for multiple secondary outcomes). There were no significant differences between the two groups in the incidences of chronic lung disease or other major morbidities.Among preterm infants, delayed cord clamping did not result in a lower incidence of the combined outcome of death or major morbidity at 36 weeks of gestation than immediate cord clamping. (Funded by the Australian National Health and Medical Research Council [NHMRC] and the NHMRC Clinical Trials Centre; APTS Australian and New Zealand Clinical Trials Registry number, ACTRN12610000633088 .).

Abstract The rapid spread of COVID-19 is motivating development of antivirals targeting conserved SARS-CoV-2 molecular machinery. The SARS-CoV-2 genome includes conserved RNA elements that offer potential small-molecule drug targets, but most of their 3D structures have not been experimentally characterized. Here, we provide a compilation of chemical mapping data from our and other labs, secondary structure models, and 3D model ensembles based on Rosetta’s FARFAR2 algorithm for SARS-CoV-2 RNA regions including the individual stems SL1-8 in the extended 5’ UTR; the reverse complement of the 5’ UTR SL1-4; the frameshift stimulating element (FSE); and the extended pseudoknot, hypervariable region, and s2m of the 3’ UTR. For eleven of these elements (the stems in SL1-8, reverse complement of SL1-4, FSE, s2m, and 3’ UTR pseudoknot), modeling convergence supports the accuracy of predicted low energy states; subsequent cryo-EM characterization of the FSE confirms modeling accuracy. To aid efforts to discover small molecule RNA binders guided by computational models, we provide a second set of similarly prepared models for RNA riboswitches that bind small molecules. Both datasets (‘FARFAR2-SARS-CoV-2’, https://github.com/DasLab/FARFAR2-SARS-CoV-2 ; and ‘FARFAR2-Apo-Riboswitch’, at https://github.com/DasLab/FARFAR2-Apo-Riboswitch ’) include up to 400 models for each RNA element, which may facilitate drug discovery approaches targeting dynamic ensembles of RNA molecules.

SUMMARY Therapeutic mRNAs and vaccines are being developed for a broad range of human diseases, including COVID-19. However, their optimization is hindered by mRNA instability and inefficient protein expression. Here, we describe design principles that overcome these barriers. We develop a new RNA sequencing-based platform called PERSIST-seq to systematically delineate in-cell mRNA stability, ribosome load, as well as in-solution stability of a library of diverse mRNAs. We find that, surprisingly, in-cell stability is a greater driver of protein output than high ribosome load. We further introduce a method called In-line-seq, applied to thousands of diverse RNAs, that reveals sequence and structure-based rules for mitigating hydrolytic degradation. Our findings show that “superfolder” mRNAs can be designed to improve both stability and expression that are further enhanced through pseudouridine nucleoside modification. Together, our study demonstrates simultaneous improvement of mRNA stability and protein expression and provides a computational-experimental platform for the enhancement of mRNA medicines.

Abstract Protein design is challenging because it requires searching through a vast combinatorial space that is only sparsely functional. Self-supervised learning approaches offer the potential to navigate through this space more effectively and thereby accelerate protein engineering. We introduce a sequence denoising autoencoder (DAE) that learns the manifold of protein sequences from a large amount of potentially unlabelled proteins. This DAE is combined with a function predictor that guides sampling towards sequences with higher levels of desired functions. We train the sequence DAE on more than 20M unlabeled protein sequences spanning many evolutionarily diverse protein families and train the function predictor on approximately 0.5M sequences with known function labels. At test time, we sample from the model by iteratively denoising a sequence while exploiting the gradients from the function predictor. We present a few preliminary case studies of protein design that demonstrate the effectiveness of this proposed approach, which we refer to as “deep manifold sampling”, including metal binding site addition, function-preserving diversification, and global fold change.

Abstract Designing proteins to achieve specific functions often requires in silico modeling of their properties at high throughput scale and can significantly benefit from fast and accurate protein structure prediction. We introduce EquiFold, a new end-to-end differentiable, SE(3)-equivariant, all-atom protein structure prediction model. EquiFold uses a novel coarse-grained representation of protein structures that does not require multiple sequence alignments or protein language model embeddings, inputs that are commonly used in other state-of-the-art structure prediction models. Our method relies on geometrical structure representation and is substantially smaller than prior state-of-the-art models. In preliminary studies, EquiFold achieved comparable accuracy to AlphaFold but was orders of magnitude faster. The combination of high speed and accuracy make EquiFold suitable for a number of downstream tasks, including protein property prediction and design.

Summary Methods to predict RNA 3D structures from sequence are needed to understand the exploding number of RNA molecules being discovered across biology. As assessed during community-wide RNA-Puzzles trials, Rosetta’s Fragment Assembly of RNA with Full-Atom Refinement (FARFAR) enables accurate prediction of complex folds, but it remains unclear how much human intervention and experimental guidance is needed to achieve this performance. Here, we present FARFAR2, a protocol integrating recent innovations with updated RNA fragment libraries and helix modeling. In 16 of 21 RNA-Puzzles revisited without experimental data or expert intervention, FARFAR2 recovers structures that are more accurate than the original models submitted by our group and other participants during the RNA-Puzzles trials. In five prospective tests, pre-registered FARFAR2 models for riboswitches and adenovirus VA-I achieved 3–8 Å RMSD accuracies. Finally, we present a server and three large model archives (FARFAR2-Classics, FARFAR2-Motifs, and FARFAR2-Puzzles) to guide future applications and advances.