We investigated SARS-CoV-2 potential tropism by surveying expression of viral entry-associated genes in single-cell RNA-sequencing data from multiple tissues from healthy human donors. We co-detected these transcripts in specific respiratory, corneal and intestinal epithelial cells, potentially explaining the high efficiency of SARS-CoV-2 transmission. These genes are co-expressed in nasal epithelial cells with genes involved in innate immunity, highlighting the cells' potential role in initial viral infection, spread and clearance. The study offers a useful resource for further lines of inquiry with valuable clinical samples from COVID-19 patients and we provide our data in a comprehensive, open and user-friendly fashion at www.covid19cellatlas.org.

Human lungs enable efficient gas exchange and form an interface with the environment, which depends on mucosal immunity for protection against infectious agents. Tightly controlled interactions between structural and immune cells are required to maintain lung homeostasis. Here, we use single-cell transcriptomics to chart the cellular landscape of upper and lower airways and lung parenchyma in healthy lungs, and lower airways in asthmatic lungs. We report location-dependent airway epithelial cell states and a novel subset of tissue-resident memory T cells. In the lower airways of patients with asthma, mucous cell hyperplasia is shown to stem from a novel mucous ciliated cell state, as well as goblet cell hyperplasia. We report the presence of pathogenic effector type 2 helper T cells (TH2) in asthmatic lungs and find evidence for type 2 cytokines in maintaining the altered epithelial cell states. Unbiased analysis of cell–cell interactions identifies a shift from airway structural cell communication in healthy lungs to a TH2-dominated interactome in asthmatic lungs. Single-cell transcriptomics reveals immune and stromal compartment remodeling, including the enrichment of unique populations of epithelial cells and CD4+ T cells, in asthmatic lungs

Abstract Single-cell technologies have transformed our understanding of human tissues. Yet, studies typically capture only a limited number of donors and disagree on cell type definitions. Integrating many single-cell datasets can address these limitations of individual studies and capture the variability present in the population. Here we present the integrated Human Lung Cell Atlas (HLCA), combining 49 datasets of the human respiratory system into a single atlas spanning over 2.4 million cells from 486 individuals. The HLCA presents a consensus cell type re-annotation with matching marker genes, including annotations of rare and previously undescribed cell types. Leveraging the number and diversity of individuals in the HLCA, we identify gene modules that are associated with demographic covariates such as age, sex and body mass index, as well as gene modules changing expression along the proximal-to-distal axis of the bronchial tree. Mapping new data to the HLCA enables rapid data annotation and interpretation. Using the HLCA as a reference for the study of disease, we identify shared cell states across multiple lung diseases, including SPP1 + profibrotic monocyte-derived macrophages in COVID-19, pulmonary fibrosis and lung carcinoma. Overall, the HLCA serves as an example for the development and use of large-scale, cross-dataset organ atlases within the Human Cell Atlas.

Abstract Cell type-specific differential gene expression analyses based on single-cell transcriptome datasets are sensitive to the presence of cell-free mRNA in the droplets containing single cells. This so-called ambient RNA contamination may differ between samples obtained from patients and healthy controls. Current ambient RNA correction methods were not developed specifically for single-cell differential gene expression (sc-DGE) analyses and might therefore not sufficiently correct for ambient RNA-derived signals. Here, we show that ambient RNA levels are highly sample-specific. We found that without ambient RNA correction, sc-DGE analyses erroneously identify transcripts originating from ambient RNA as cell type-specific disease-associated genes. We therefore developed a computationally lean and intuitive correction method, Fast Correction for Ambient RNA (FastCAR), optimized for sc-DGE analysis of scRNA-Seq datasets generated by droplet-based methods including the 10XGenomics Chromium platform. FastCAR uses the profile of transcripts observed in libraries that likely represent empty droplets to determine the level of ambient RNA in each individual sample, and then corrects for these ambient RNA gene expression values. FastCAR can be applied as part of the data pre-processing and QC in sc-DGE workflows comparing scRNA-Seq data in a health versus disease experimental design. We compared FastCAR with two methods previously developed to remove ambient RNA, SoupX and CellBender. All three methods identified additional genes in sc-DGE analyses that were not identified in the absence of ambient RNA correction. However, we show that FastCAR performs better at correcting gene expression values attributed to ambient RNA, resulting in a lower frequency of false-positive observations. Moreover, the use of FastCAR in a sc-DGE workflow increases the cell-type specificity of sc-DGE analyses across disease conditions.

The human intestinal epithelial barrier is shaped by various biological and biomechanical influences such as growth factor gradients and the flow of intestinal contents. Exposure to these cues in vitro impacts the cell type composition and function of adult stem cell (ASC)-derived intestinal epithelial cells, but their effect on human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived cells is largely unexplored. Here, we characterize and compare the cellular composition and gene expression profiles of hiPSC-derived intestinal epithelial cells exposed to various medium compositions and cultured as organoids, in Transwell and in microfluidic intestine-on-chip systems. We demonstrate that inhibition and activation of the WNT, BMP, NOTCH and MAPK pathways regulates the presence of dividing, absorptive and secretory epithelial lineages within these systems, as has been described for ASC-based systems. Upon differentiation, intestinal epithelial organoids and monolayers in Transwell systems expressed genes involved in important intestinal functions, including digestive enzymes, nutrient transporters and members of the Cytochrome P450 family implicated in drug metabolism. However, the dynamic microenvironment of the intestine-on-chip system induced the strongest upregulation of these genes, with an expression profile that suggests a more mature developmental state. Overall, these results underscore the value of hiPSC-derived intestinal epithelial cells for modeling important functions of the human intestinal epithelial barrier and facilitates the selection of relevant culture conditions for specific applications.

Human lungs enable efficient gas exchange, and form an interface with the environment which depends on mucosal immunity for protection against infectious agents. Tightly controlled interactions between structural and immune cells are required to maintain lung homeostasis. Here, we use single cell transcriptomics to chart the cellular landscape of upper and lower airways and lung parenchyma in health. We report location-dependent airway epithelial cell states, and a novel subset of tissue-resident memory T cells. In lower airways of asthma patients, mucous cell hyperplasia is shown to stem from a novel mucous ciliated cell state, as well as goblet cell hyperplasia. We report presence of pathogenic effector Th2 cells in asthma, and find evidence for type-2 cytokines in maintaining the altered epithelial cell states. Unbiased analysis of cell-cell interactions identify a shift from airway structural cell communication in health to a Th2-dominated interactome in asthma.

Rationale: Severe asthma and COPD share common pathophysiologic traits such as relative corticosteroid insensitivity. We recently published three transcriptome-associated clusters (TACs) using hierarchical analysis of the sputum transcriptome in asthmatics from the U-BIOPRED cohort with one Type 2-high signature (TAC1) and 2 Type 2-low signatures. Objective: We examined whether gene expression signatures obtained in asthma can be used to identify subgroup of COPD patients with steroid sensitivity. Methods: Using gene set variation analysis (GSVA), we examined the distribution and enrichment scores (ES) of the 3 TACs in the transcriptome of bronchial biopsies from 46 patients who participated in the GLUCOLD COPD study that received 30 months of treatment with inhaled corticosteroids (ICS) with and without an added long-acting b-agonist (LABA). The identified signatures were then associated to longitudinal clinical variables after treatment. Measurements and main results: Bronchial biopsies in COPD patients at baseline showed a wide range of expression of the 3 TACs. After ICS+/-LABA treatment, the ES of TAC1 was significantly reduced at 30 months, but those of TAC2 and TAC3 were unaffected. A corticosteroid-sensitive TAC1 (sub)signature was developed from the TAC1 ICS-responsive genes. This signature consisted of mast cell specific genes identified by single-cell RNA seq, and positively correlated with bronchial biopsy mast cell numbers following ICS+/-LABA. Baseline levels of gene transcription predicted change in FEV1 %predicted following 30 month ICS+/-LABA . Conclusions: Sputum-derived transcriptomic signatures from an asthma cohort can be recapitulated in bronchial biopsies of COPD patients and identified airway wall mast cells as a predictor of those COPD patients who will benefit from inhaled corticosteroids.

The COVID-19 pandemic, caused by the novel coronavirus SARS-CoV-2, creates an urgent need for identifying molecular mechanisms that mediate viral entry, propagation, and tissue pathology. Cell membrane bound angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and associated proteases, transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2) and Cathepsin L (CTSL), were previously identified as mediators of SARS-CoV2 cellular entry. Here, we assess the cell type-specific RNA expression of ACE2, TMPRSS2, and CTSL through an integrated analysis of 107 single-cell and single-nucleus RNA-Seq studies, including 22 lung and airways datasets (16 unpublished), and 85 datasets from other diverse organs. Joint expression of ACE2 and the accessory proteases identifies specific subsets of respiratory epithelial cells as putative targets of viral infection in the nasal passages, airways, and alveoli. Cells that co-express ACE2 and proteases are also identified in cells from other organs, some of which have been associated with COVID-19 transmission or pathology, including gut enterocytes, corneal epithelial cells, cardiomyocytes, heart pericytes, olfactory sustentacular cells, and renal epithelial cells. Performing the first meta-analyses of scRNA-seq studies, we analyzed 1,176,683 cells from 282 nasal, airway, and lung parenchyma samples from 164 donors spanning fetal, childhood, adult, and elderly age groups, associate increased levels of ACE2, TMPRSS2, and CTSL in specific cell types with increasing age, male gender, and smoking, all of which are epidemiologically linked to COVID-19 susceptibility and outcomes. Notably, there was a particularly low expression of ACE2 in the few young pediatric samples in the analysis. Further analysis reveals a gene expression program shared by ACE2+TMPRSS2+ cells in nasal, lung and gut tissues, including genes that may mediate viral entry, subtend key immune functions, and mediate epithelial-macrophage cross-talk. Amongst these are IL6, its receptor and co-receptor, IL1R, TNF response pathways, and complement genes. Cell type specificity in the lung and airways and smoking effects were conserved in mice. Our analyses suggest that differences in the cell type-specific expression of mediators of SARS-CoV-2 viral entry may be responsible for aspects of COVID-19 epidemiology and clinical course, and point to putative molecular pathways involved in disease susceptibility and pathogenesis.### Competing Interest StatementN.K. was a consultant to Biogen Idec, Boehringer Ingelheim, Third Rock, Pliant, Samumed, NuMedii, Indaloo, Theravance, LifeMax, Three Lake Partners, Optikira and received non-financial support from MiRagen. All of these outside the work reported. J.L. is a scientific consultant for 10X Genomics Inc A.R. is a co-founder and equity holder of Celsius Therapeutics, an equity holder in Immunitas, and an SAB member of ThermoFisher Scientific, Syros Pharmaceuticals, Asimov, and Neogene Therapeutics O.R.R., is a co-inventor on patent applications filed by the Broad Institute to inventions relating to single cell genomics applications, such as in PCT/US2018/060860 and US Provisional Application No. 62/745,259. A.K.S. compensation for consulting and SAB membership from Honeycomb Biotechnologies, Cellarity, Cogen Therapeutics, Orche Bio, and Dahlia Biosciences. S.A.T. was a consultant at Genentech, Biogen and Roche in the last three years. F.J.T. reports receiving consulting fees from Roche Diagnostics GmbH, and ownership interest in Cellarity Inc. L.V. is funder of Definigen and Bilitech two biotech companies using hPSCs and organoid for disease modelling and cell based therapy.

ABSTRACT Organ- and body-scale cell atlases have the potential to transform our understanding of human biology. To capture the variability present in the population, these atlases must include diverse demographics such as age and ethnicity from both healthy and diseased individuals. The growth in both size and number of single-cell datasets, combined with recent advances in computational techniques, for the first time makes it possible to generate such comprehensive large-scale atlases through integration of multiple datasets. Here, we present the integrated Human Lung Cell Atlas (HLCA) combining 46 datasets of the human respiratory system into a single atlas spanning over 2.2 million cells from 444 individuals across health and disease. The HLCA contains a consensus re-annotation of published and newly generated datasets, resolving under- or misannotation of 59% of cells in the original datasets. The HLCA enables recovery of rare cell types, provides consensus marker genes for each cell type, and uncovers gene modules associated with demographic covariates and anatomical location within the respiratory system. To facilitate the use of the HLCA as a reference for single-cell lung research and allow rapid analysis of new data, we provide an interactive web portal to project datasets onto the HLCA. Finally, we demonstrate the value of the HLCA reference for interpreting disease-associated changes. Thus, the HLCA outlines a roadmap for the development and use of organ-scale cell atlases within the Human Cell Atlas.