Single-cell technologies have transformed our understanding of human tissues. Yet, studies typically capture only a limited number of donors and disagree on cell type definitions. Integrating many single-cell datasets can address these limitations of individual studies and capture the variability present in the population. Here we present the integrated Human Lung Cell Atlas (HLCA), combining 49 datasets of the human respiratory system into a single atlas spanning over 2.4 million cells from 486 individuals. The HLCA presents a consensus cell type re-annotation with matching marker genes, including annotations of rare and previously undescribed cell types. Leveraging the number and diversity of individuals in the HLCA, we identify gene modules that are associated with demographic covariates such as age, sex and body mass index, as well as gene modules changing expression along the proximal-to-distal axis of the bronchial tree. Mapping new data to the HLCA enables rapid data annotation and interpretation. Using the HLCA as a reference for the study of disease, we identify shared cell states across multiple lung diseases, including SPP1

ABSTRACT Organ- and body-scale cell atlases have the potential to transform our understanding of human biology. To capture the variability present in the population, these atlases must include diverse demographics such as age and ethnicity from both healthy and diseased individuals. The growth in both size and number of single-cell datasets, combined with recent advances in computational techniques, for the first time makes it possible to generate such comprehensive large-scale atlases through integration of multiple datasets. Here, we present the integrated Human Lung Cell Atlas (HLCA) combining 46 datasets of the human respiratory system into a single atlas spanning over 2.2 million cells from 444 individuals across health and disease. The HLCA contains a consensus re-annotation of published and newly generated datasets, resolving under- or misannotation of 59% of cells in the original datasets. The HLCA enables recovery of rare cell types, provides consensus marker genes for each cell type, and uncovers gene modules associated with demographic covariates and anatomical location within the respiratory system. To facilitate the use of the HLCA as a reference for single-cell lung research and allow rapid analysis of new data, we provide an interactive web portal to project datasets onto the HLCA. Finally, we demonstrate the value of the HLCA reference for interpreting disease-associated changes. Thus, the HLCA outlines a roadmap for the development and use of organ-scale cell atlases within the Human Cell Atlas.

Abstract The use of single-cell technologies for clinical applications requires disconnecting sampling from downstream processing steps. Early sample preservation can further increase robustness and reproducibility by avoiding artifacts introduced during specimen handling. We present FixNCut, a methodology for the reversible fixation of tissue followed by dissociation that overcomes current limitations. We applied FixNCut to human and mouse tissues to demonstrate the preservation of RNA integrity, sequencing library complexity, and cellular composition, while diminishing stress-related artifacts. Besides single-cell RNA sequencing, FixNCut is compatible with multiple single-cell and spatial technologies, making it a versatile tool for robust and flexible study designs.

Abstract In patients with asthma, respiratory syncytial virus (RSV) infections can cause disease exacerbations by infecting the epithelial layer of the airways, inducing an innate and adaptive immune response. The type-I interferon antiviral response of epithelial cells upon RSV infection is found to be reduced in asthma in most -but not all-studies. Moreover, the molecular mechanisms that cause the differences in the asthmatic bronchial epithelium in response to viral infection are poorly understood. Here, we investigated the transcriptional response to RSV infection of primary bronchial epithelial cells (pBECs) from asthma patients(n=8) and healthy donors(n=8). The pBECs obtained from bronchial brushes were differentiated in air-liquid interface conditions and infected with RSV. After three days, cells were processed for single-cell RNA sequencing. A strong antiviral response to RSV was observed for all cell types present, from both asthma patients and healthy donors. Most differentially regulated genes following RSV infection were found in cells transitioning from basal to secretory. Goblet cells from asthma patients showed lower expression of genes involved in the interferon response. In multiciliated cells, an impairment of the signaling pathways involved in the response to RSV in asthma was observed, including no enrichment of the type-III interferon response. Our results highlight that the response to RSV infection of the bronchial epithelium in asthma and healthy airways was largely similar. However, in asthma, the response of goblet and the multiciliated cells was impaired, highlighting the need for studying airway epithelial cells at high resolution in the context of asthma exacerbations. What is already know on this topic The airway epithelium response to RSV is altered in asthma. However, literature remains conflicted about the exact changes in the antiviral response, and the mechanisms causing these changes are yet to be found. What this study adds This study describes extensively the response of the bronchial epithelial cells (BECs) to RSV for both healthy subjects and asthma patients, at a single-cell resolution. It highlights the major overlap between healthy and asthma in the antiviral response to RSV. It allows the identification of specific genes and cell types that show a different behavior in response to RSV in asthma compared to healthy. How this study might affect research, practice or policy Our study indicates that goblet and multiciliated cells are the most relevant BECs to further investigate in the context of drug development for RSV-induced asthma exacerbation. It also suggests that focusing research on the cross-talk between the epithelial and the immune cells, or into investigating a potential delayed response in asthma would be the best way forward into understanding the mechanisms involved in the asthma response to RSV.