Computational trajectory inference enables the reconstruction of cell state dynamics from single-cell RNA sequencing experiments. However, trajectory inference requires that the direction of a biological process is known, largely limiting its application to differentiating systems in normal development. Here, we present CellRank ( https://cellrank.org ) for single-cell fate mapping in diverse scenarios, including regeneration, reprogramming and disease, for which direction is unknown. Our approach combines the robustness of trajectory inference with directional information from RNA velocity, taking into account the gradual and stochastic nature of cellular fate decisions, as well as uncertainty in velocity vectors. On pancreas development data, CellRank automatically detects initial, intermediate and terminal populations, predicts fate potentials and visualizes continuous gene expression trends along individual lineages. Applied to lineage-traced cellular reprogramming data, predicted fate probabilities correctly recover reprogramming outcomes. CellRank also predicts a new dedifferentiation trajectory during postinjury lung regeneration, including previously unknown intermediate cell states, which we confirm experimentally.

Abstract Computational trajectory inference enables the reconstruction of cell-state dynamics from single-cell RNA sequencing experiments. However, trajectory inference requires that the direction of a biological process is known, largely limiting its application to differentiating systems in normal development. Here, we present CellRank ( https://cellrank.org ) for mapping the fate of single cells in diverse scenarios, including perturbations such as regeneration or disease, for which direction is unknown. Our approach combines the robustness of trajectory inference with directional information from RNA velocity, derived from ratios of spliced to unspliced reads. CellRank takes into account both the gradual and stochastic nature of cellular fate decisions, as well as uncertainty in RNA velocity vectors. On data from pancreas development, we show that it automatically detects initial, intermediate and terminal populations, predicts fate potentials and visualizes continuous gene expression trends along individual lineages. CellRank also predicts a novel dedifferentiation trajectory during regeneration after lung injury, which we follow up experimentally by confirming the existence of previously unknown intermediate cell states.

Abstract Single-cell proteomics by mass spectrometry (MS) is emerging as a powerful and unbiased method for the characterization of biological heterogeneity. So far, it has been limited to cultured cells, whereas an expansion of the method to complex tissues would greatly enhance biological insights. Here we describe single-cell Deep Visual Proteomics (scDVP), a technology that integrates high-content imaging, laser microdissection and multiplexed MS. scDVP resolves the context-dependent, spatial proteome of murine hepatocytes at a current depth of 1,700 proteins from a slice of a cell. Half of the proteome was differentially regulated in a spatial manner, with protein levels changing dramatically in proximity to the central vein. We applied machine learning to proteome classes and images, which subsequently inferred the spatial proteome from imaging data alone. scDVP is applicable to healthy and diseased tissues and complements other spatial proteomics or spatial omics technologies.

ABSTRACT Pulmonary fibrosis develops as a consequence of failed regeneration after injury. Analyzing mechanisms of regeneration and fibrogenesis directly in human tissue has been hampered by the lack of organotypic models and analytical techniques. In this work, we coupled ex vivo cytokine and drug perturbations of human precision-cut lung slices (hPCLS) with scRNAseq and induced a multi-lineage circuit of fibrogenic cell states in hPCLS, which we show to be highly similar to the in vivo cell circuit in a multi-cohort lung cell atlas from pulmonary fibrosis patients. Using micro-CT staged patient tissues, we characterized the appearance and interaction of myofibroblasts, an ectopic endothelial cell state and basaloid epithelial cells in the thickened alveolar septum of early-stage lung fibrosis. Induction of these states in the ex vivo hPCLS model provides evidence that the basaloid cell state was derived from alveolar type-2 cells, whereas the ectopic endothelial cell state emerged from capillary cell plasticity. Cell-cell communication routes in patients were largely conserved in the hPCLS model and anti-fibrotic drug treatments showed highly cell type specific effects. Our work provides an experimental framework for perturbational single cell genomics directly in human lung tissue that enables analysis of tissue homeostasis, regeneration and pathology. We further demonstrate that hPCLS offers novel avenues for scalable, high-resolution drug testing to accelerate anti-fibrotic drug development and translation.

ABSTRACT Organ- and body-scale cell atlases have the potential to transform our understanding of human biology. To capture the variability present in the population, these atlases must include diverse demographics such as age and ethnicity from both healthy and diseased individuals. The growth in both size and number of single-cell datasets, combined with recent advances in computational techniques, for the first time makes it possible to generate such comprehensive large-scale atlases through integration of multiple datasets. Here, we present the integrated Human Lung Cell Atlas (HLCA) combining 46 datasets of the human respiratory system into a single atlas spanning over 2.2 million cells from 444 individuals across health and disease. The HLCA contains a consensus re-annotation of published and newly generated datasets, resolving under- or misannotation of 59% of cells in the original datasets. The HLCA enables recovery of rare cell types, provides consensus marker genes for each cell type, and uncovers gene modules associated with demographic covariates and anatomical location within the respiratory system. To facilitate the use of the HLCA as a reference for single-cell lung research and allow rapid analysis of new data, we provide an interactive web portal to project datasets onto the HLCA. Finally, we demonstrate the value of the HLCA reference for interpreting disease-associated changes. Thus, the HLCA outlines a roadmap for the development and use of organ-scale cell atlases within the Human Cell Atlas.

Abstract Nanomaterials emerged as boundless resource of innovation, but their shape and biopersistence related to respiratory toxicology raise longstanding concerns. The development of predictive safety tests for inhaled nanomaterials, however, is hampered by limited understanding of cell type-specific responses. To advance this knowledge, we used single-cell RNA-sequencing to longitudinally analyze cellular perturbations in mice, caused by three carbonaceous nanomaterials of different shape and toxicity upon pulmonary delivery. Focusing on nanomaterial-specific dynamics of lung inflammation, we found persistent depletion of alveolar macrophages by fiber-shaped nanotubes. While only little involvement was observed for alveolar macrophages during the initiation phase, they emerged, together with infiltrating monocyte-derived macrophages, as decisive factors in shifting inflammation towards resolution for spherical nanomaterials, or chronic inflammation for fibers. Fibroblasts, central for fibrosis, sensed macrophage and epithelial signals and emerged as orchestrators of nanomaterial-induced inflammation. Thus, the mode of actions identified in this study will significantly inspire the precision of future in vitro testing. Graphical abstract

Abstract Antifibrotic therapy with nintedanib is the clinical mainstay in the treatment of progressive fibrosing interstitial lung disease (ILD). High-dimensional medical image analysis, known as radiomics, provides quantitative insights into organ-scale pathophysiology, generating digital disease fingerprints. Here, we used an integrative analysis of radiomic and proteomic profiles (radioproteomics) to assess whether changes in radiomic signatures can stratify the degree of antifibrotic response to nintedanib in (experimental) fibrosing ILD. Unsupervised clustering of delta radiomic profiles revealed two distinct imaging phenotypes in mice treated with nintedanib, contrary to conventional densitometry readouts, which showed a more uniform response. Integrative analysis of delta radiomics and proteomics demonstrated that these phenotypes reflected different treatment response states, as further evidenced on transcriptional and cellular levels. Importantly, radioproteomics signatures paralleled disease- and drug related biological pathway activity with high specificity, including extracellular matrix (ECM) remodeling, cell cycle activity, wound healing, and metabolic activity. Evaluation of the preclinical molecular response-defining features, particularly those linked to ECM remodeling, in a cohort of nintedanib-treated fibrosing ILD patients, accurately stratified patients based on their extent of lung function decline. In conclusion, delta radiomics has great potential to serve as a non-invasive and readily accessible surrogate of molecular response phenotypes in fibrosing ILD. This could pave the way for personalized treatment strategies and improved patient outcomes.