Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a lethal interstitial lung disease characterized by airway remodeling, inflammation, alveolar destruction, and fibrosis. We utilized single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to identify epithelial cell types and associated biological processes involved in the pathogenesis of IPF. Transcriptomic analysis of normal human lung epithelial cells defined gene expression patterns associated with highly differentiated alveolar type 2 (AT2) cells, indicated by enrichment of RNAs critical for surfactant homeostasis. In contrast, scRNA-seq of IPF cells identified 3 distinct subsets of epithelial cell types with characteristics of conducting airway basal and goblet cells and an additional atypical transitional cell that contributes to pathological processes in IPF. Individual IPF cells frequently coexpressed alveolar type 1 (AT1), AT2, and conducting airway selective markers, demonstrating “indeterminate” states of differentiation not seen in normal lung development. Pathway analysis predicted aberrant activation of canonical signaling via TGF-β, HIPPO/YAP, P53, WNT, and AKT/PI3K. Immunofluorescence confocal microscopy identified the disruption of alveolar structure and loss of the normal proximal-peripheral differentiation of pulmonary epithelial cells. scRNA-seq analyses identified loss of normal epithelial cell identities and unique contributions of epithelial cells to the pathogenesis of IPF. The present study provides a rich data source to further explore lung health and disease.

Various acute and chronic inflammatory stimuli increase the number and activity of pulmonary mucus-producing goblet cells, and goblet cell hyperplasia and excess mucus production are central to the pathogenesis of chronic pulmonary diseases. However, little is known about the transcriptional programs that regulate goblet cell differentiation. Here, we show that SAM-pointed domain–containing Ets-like factor (SPDEF) controls a transcriptional program critical for pulmonary goblet cell differentiation in mice. Initial cell-lineage–tracing analysis identified nonciliated secretory epithelial cells, known as Clara cells, as the progenitors of goblet cells induced by pulmonary allergen exposure in vivo. Furthermore, in vivo expression of SPDEF in Clara cells caused rapid and reversible goblet cell differentiation in the absence of cell proliferation. This was associated with enhanced expression of genes regulating goblet cell differentiation and protein glycosylation, including forkhead box A3 (Foxa3), anterior gradient 2 (Agr2), and glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type (Gcnt3). Consistent with these findings, levels of SPDEF and FOXA3 were increased in mouse goblet cells after sensitization with pulmonary allergen, and the proteins were colocalized in goblet cells lining the airways of patients with chronic lung diseases. Deletion of the mouse Spdef gene resulted in the absence of goblet cells in tracheal/laryngeal submucosal glands and in the conducting airway epithelium after pulmonary allergen exposure in vivo. These data show that SPDEF plays a critical role in regulating a transcriptional network mediating the goblet cell differentiation and mucus hyperproduction associated with chronic pulmonary disorders.

A major challenge in developmental biology is to understand the genetic and cellular processes/programs driving organ formation and differentiation of the diverse cell types that comprise the embryo. While recent studies using single cell transcriptome analysis illustrate the power to measure and understand cellular heterogeneity in complex biological systems, processing large amounts of RNA-seq data from heterogeneous cell populations creates the need for readily accessible tools for the analysis of single-cell RNA-seq (scRNA-seq) profiles. The present study presents a generally applicable analytic pipeline (SINCERA: a computational pipeline for SINgle CEll RNA-seq profiling Analysis) for processing scRNA-seq data from a whole organ or sorted cells. The pipeline supports the analysis for: 1) the distinction and identification of major cell types; 2) the identification of cell type specific gene signatures; and 3) the determination of driving forces of given cell types. We applied this pipeline to the RNA-seq analysis of single cells isolated from embryonic mouse lung at E16.5. Through the pipeline analysis, we distinguished major cell types of fetal mouse lung, including epithelial, endothelial, smooth muscle, pericyte, and fibroblast-like cell types, and identified cell type specific gene signatures, bioprocesses, and key regulators. SINCERA is implemented in R, licensed under the GNU General Public License v3, and freely available from CCHMC PBGE website, https://research.cchmc.org/pbge/sincera.html.

Single-cell technologies have transformed our understanding of human tissues. Yet, studies typically capture only a limited number of donors and disagree on cell type definitions. Integrating many single-cell datasets can address these limitations of individual studies and capture the variability present in the population. Here we present the integrated Human Lung Cell Atlas (HLCA), combining 49 datasets of the human respiratory system into a single atlas spanning over 2.4 million cells from 486 individuals. The HLCA presents a consensus cell type re-annotation with matching marker genes, including annotations of rare and previously undescribed cell types. Leveraging the number and diversity of individuals in the HLCA, we identify gene modules that are associated with demographic covariates such as age, sex and body mass index, as well as gene modules changing expression along the proximal-to-distal axis of the bronchial tree. Mapping new data to the HLCA enables rapid data annotation and interpretation. Using the HLCA as a reference for the study of disease, we identify shared cell states across multiple lung diseases, including SPP1

The respiratory system undergoes a diversity of structural, biochemical, and functional changes necessary for adaptation to air breathing at birth. To identify the heterogeneity of pulmonary cell types and dynamic changes in gene expression mediating adaptation to respiration, here we perform single cell RNA analyses of mouse lung on postnatal day 1. Using an iterative cell type identification strategy we unbiasedly identify the heterogeneity of murine pulmonary cell types. We identify distinct populations of epithelial, endothelial, mesenchymal, and immune cells, each containing distinct subpopulations. Furthermore we compare temporal changes in RNA expression patterns before and after birth to identify signaling pathways selectively activated in specific pulmonary cell types, including activation of cell stress and the unfolded protein response during perinatal adaptation of the lung. The present data provide a single cell view of the adaptation to air breathing after birth.

The Hippo/Yap pathway is a well-conserved signaling cascade that regulates cell proliferation and differentiation to control organ size and stem/progenitor cell behavior. Following airway injury, Yap was dynamically regulated in regenerating airway epithelial cells. To determine the role of Hippo signaling in the lung, the mammalian Hippo kinases, Mst1 and Mst2, were deleted in epithelial cells of the embryonic and mature mouse lung. Mst1/2 deletion in the fetal lung enhanced proliferation and inhibited sacculation and epithelial cell differentiation. The transcriptional inhibition of cell proliferation and activation of differentiation during normal perinatal lung maturation were inversely regulated following embryonic Mst1/2 deletion. Ablation of Mst1/2 from bronchiolar epithelial cells in the adult lung caused airway hyperplasia and altered differentiation. Inhibitory Yap phosphorylation was decreased and Yap nuclear localization and transcriptional targets were increased after Mst1/2 deletion, consistent with canonical Hippo/Yap signaling. YAP potentiated cell proliferation and inhibited differentiation of human bronchial epithelial cells in vitro. Loss of Mst1/2 and expression of YAP regulated transcriptional targets controlling cell proliferation and differentiation, including Ajuba LIM protein. Ajuba was required for the effects of YAP on cell proliferation in vitro. Hippo/Yap signaling regulates Ajuba and controls proliferation and differentiation of lung epithelial progenitor cells.

Abstract Rationale While animal model studies have extensively defined mechanisms controlling cell diversity in the developing mammalian lung, the limited data available from late stage human lung development represents a significant knowledge gap. The NHLBI Molecular Atlas of Lung Development Program (LungMAP) seeks to fill this gap by creating a structural, cellular and molecular atlas of the human and mouse lung. Methods Single cell RNA sequencing generated transcriptional profiles of 5500 cells obtained from two one-day old human lungs (born at gestational ages of 39 and 31 weeks) from the LungMAP Human Tissue Core Biorepository at the University of Rochester. Frozen single cell isolates were captured, and library preparation was completed on the Chromium 10X system. Data was analyzed in Seurat, and cellular annotation was performed using the ToppGene functional analysis tool. Single cell sequence data from 32000 postnatal day 1, 3, 7 and 10 mouse lung (n = 2 at each time point) cells generated by the LungMAP Research Center at Cincinnati Children’s Hospital and Medical Center, using Dropseq platform, was integrated with the human data. In situ hybridization was used to confirm the spatial location of cellular phenotypes. Results Transcriptional interrogation of donor newborn human lung cells identified distinct clusters representing multiple populations of epithelial, endothelial, fibroblasts, pericytes, smooth muscle, and immune cells and signature genes for each of these populations were identified. Computational integration of newborn human and postnatal mouse lung development cellular transcriptomes facilitated the identification of distinct cellular lineages among all the major cell types. Integration of the human and mouse cellular transcriptomes also demonstrated cell type-specific differences in developmental states of the newborn human lung cells. In particular, matrix fibroblasts could be separated into those representative of younger cells (n=393), or older cells (n=158). This is the first comprehensive molecular map of the cellular landscape of neonatal human lung, including biomarkers for cells at distinct states of development. Our results indicate that integrated single cell RNA profiling of human and mouse lung will help identify common and species-specific mechanisms of lung development and respiratory disease.

ABSTRACT Accurate cell type identification is a key and rate-limiting step in single cell data analysis. Single cell references with comprehensive cell types, reproducible and functional validated cell identities, and common nomenclatures are much needed by the research community to optimize automated cell type annotation and facilitate data integration, sharing, and collaboration. In the present study, we developed a novel computational pipeline to utilize the LungMAP CellCards as a dictionary to consolidate single-cell transcriptomic datasets of 104 human lungs and 17 mouse lung samples and constructed “LungMAP CellRef” and “LungMAP CellRef Seed” for both normal human and mouse lungs. “CellRef Seed” has an equivalent prediction power and produces consistent cell annotation as does “CellRef” but improves computational efficiency and simplifies its utilization for fast automated cell type annotation and online visualization. This atlas set incorporates 48 human and 40 mouse well-defined lung cell types catalogued from diverse anatomic locations and developmental time points. Using independent datasets, we demonstrated the utility of our CellRefs for automated cell type annotation analysis of both normal and disease lungs. User-friendly web interfaces were developed to support easy access and maximal utilization of the LungMAP CellRefs. LungMAP CellRefs are freely available to the pulmonary research community through fast interactive web interfaces to facilitate hypothesis generation, research discovery, and identification of cell type alterations in disease conditions.

Abstract Objectives Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) primarily affects the aged population and is characterized by failure of alveolar regeneration leading to loss of alveolar type 1 cells (AT1). Aged mouse models of lung repair have demonstrated that regeneration fails with increased age. Mouse and rat lung repair models have shown retinoic acid (RA) treatment can restore alveolar regeneration. Herein we seek to determine the signaling mechanisms by which RA treatment prior to injury supports alveolar differentiation. Design Partial pneumonectomy (PNX) lung injury model and next generation sequencing of sorted cell populations are used to uncover molecular targets regulating alveolar repair. In-vitro organoids generated from Mouse or IPF patient epithelial cells co-cultured with young, aged, or RA pretreated murine mesenchyme are used to test potential targets. Main outcome measurements Known alveolar epithelial cell differentiation markers, including HOPX and AGER for AT1 cells are used to assess outcome of treatments. Results Gene expression analysis of sorted fibroblasts and epithelial cells isolated from lungs of young, aged, and RA treated aged mice predicted increased PDGFA signaling that coincided with regeneration and alveolar epithelial differentiation. Addition of PDGFA induced AT1 and AT2 alveolar differentiation in both mouse and human IPF lung organoids generated with aged fibroblasts and PDGFA monoclonal antibody blocked AT1 cell differentiation in organoids generated with young murine fibroblasts. Conclusions Our data support the concept that reciprocal PDGFA signaling activates regenerative fibroblasts that support alveolar epithelial cell differentiation and repair, providing a potential therapeutic strategy to influence the pathogenesis of IPF. Key Question Which epithelial-mesenchymal crosstalk pathways are activated by RA pretreatment of aged lungs that support realveolarization after partial pneumonectomy surgery? Bottom Line Increased PDGFA/PDGFRA signaling in aged lungs promotes regenerative activation of interstitial matrixfibroblast which is required for AT2 to AT1 differentiation and alveolar regeneration. Read On In-vitro and in-vivo analysis demonstrated that PDGFA signaling supports alveolar matrixfibroblast and AT1 epithelial cell differentiation, both necessary for alveolar regeneration in aged lungs.

Abstract Lymphangioleiomyomatosis (LAM) is a rare disease which causes lung cysts and respiratory failure. TSC2 deficient ‘LAM cells’ with dysregulated mTOR signalling form nodules with fibroblasts causing lung injury. We examined if mTOR dysregulation could induce senescence and impair responses to lung injury. Senescence markers p21 and p16 were increased in LAM lungs and co-localised with alveolar type 2 cells. The SenMayo senescence gene panel was upregulated in LAM alveolar type 2 cells with senescence supressed by mTOR inhibition in patients. LAM cell / fibroblast spheroid cultures induced senescence markers in alveolar type 2 cell organoids, altered their growth and delayed epithelial scratch wound repair. Upstream regulator analysis predicted alveolar type 2 cell IL6 receptor activation. IL6 was produced by LAM cells, induced p16 and p21 in alveolar type 2 cells, inhibited epithelial wound resolution and was overexpressed in LAM patient serum where it was related to lung function. Wound repair in the presence of TSC2 null LAM cell / fibroblast spheroids was enhanced by the IL6 receptor antagonist Tocilizumab. Our findings show TSC2 loss induces senescence and IL6 production which are associated with impaired lung repair. Targeting IL6 signalling in parallel with mTOR inhibition, may reduce lung damage in LAM.