The mammalian brain consists of millions to billions of cells that are organized into many cell types with specific spatial distribution patterns and structural and functional properties1-3. Here we report a comprehensive and high-resolution transcriptomic and spatial cell-type atlas for the whole adult mouse brain. The cell-type atlas was created by combining a single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) dataset of around 7 million cells profiled (approximately 4.0 million cells passing quality control), and a spatial transcriptomic dataset of approximately 4.3 million cells using multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization (MERFISH). The atlas is hierarchically organized into 4 nested levels of classification: 34 classes, 338 subclasses, 1,201 supertypes and 5,322 clusters. We present an online platform, Allen Brain Cell Atlas, to visualize the mouse whole-brain cell-type atlas along with the single-cell RNA-sequencing and MERFISH datasets. We systematically analysed the neuronal and non-neuronal cell types across the brain and identified a high degree of correspondence between transcriptomic identity and spatial specificity for each cell type. The results reveal unique features of cell-type organization in different brain regions-in particular, a dichotomy between the dorsal and ventral parts of the brain. The dorsal part contains relatively fewer yet highly divergent neuronal types, whereas the ventral part contains more numerous neuronal types that are more closely related to each other. Our study also uncovered extraordinary diversity and heterogeneity in neurotransmitter and neuropeptide expression and co-expression patterns in different cell types. Finally, we found that transcription factors are major determinants of cell-type classification and identified a combinatorial transcription factor code that defines cell types across all parts of the brain. The whole mouse brain transcriptomic and spatial cell-type atlas establishes a benchmark reference atlas and a foundational resource for integrative investigations of cellular and circuit function, development and evolution of the mammalian brain.

Abstract Single cell transcriptomics has transformed the characterization of brain cell identity by providing quantitative molecular signatures for large, unbiased samples of brain cell populations. With the proliferation of taxonomies based on individual datasets, a major challenge is to integrate and validate results toward defining biologically meaningful cell types. We used a battery of single-cell transcriptome and epigenome measurements generated by the BRAIN Initiative Cell Census Network (BICCN) to comprehensively assess the molecular signatures of cell types in the mouse primary motor cortex (MOp). We further developed computational and statistical methods to integrate these multimodal data and quantitatively validate the reproducibility of the cell types. The reference atlas, based on more than 600,000 high quality single-cell or -nucleus samples assayed by six molecular modalities, is a comprehensive molecular account of the diverse neuronal and non-neuronal cell types in MOp. Collectively, our study indicates that the mouse primary motor cortex contains over 55 neuronal cell types that are highly replicable across analysis methods, sequencing technologies, and modalities. We find many concordant multimodal markers for each cell type, as well as thousands of genes and gene regulatory elements with discrepant transcriptomic and epigenomic signatures. These data highlight the complex molecular regulation of brain cell types and will directly enable design of reagents to target specific MOp cell types for functional analysis.

Abstract An essential step toward understanding brain function is to establish a cellular-resolution structural framework upon which multi-scale and multi-modal information spanning molecules, cells, circuits and systems can be integrated and interpreted. Here, through a collaborative effort from the Brain Initiative Cell Census Network (BICCN), we derive a comprehensive cell type-based description of one brain structure - the primary motor cortex upper limb area (MOp-ul) of the mouse. Applying state-of-the-art labeling, imaging, computational, and neuroinformatics tools, we delineated the MOp-ul within the Mouse Brain 3D Common Coordinate Framework (CCF). We defined over two dozen MOp-ul projection neuron (PN) types by their anterograde targets; the spatial distribution of their somata defines 11 cortical sublayers, a significant refinement of the classic notion of cortical laminar organization. We further combine multiple complementary tracing methods (classic tract tracing, cell type-based anterograde, retrograde, and transsynaptic viral tracing, high-throughput BARseq, and complete single cell reconstruction) to systematically chart cell type-based MOp input-output streams. As PNs link distant brain regions at synapses as well as host cellular gene expression, our construction of a PN type resolution MOp-ul wiring diagram will facilitate an integrated analysis of motor control circuitry across the molecular, cellular, and systems levels. This work further provides a roadmap towards a cellular resolution description of mammalian brain architecture.

ABSTRACT We report the generation of a multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex (MOp or M1) as the initial product of the BRAIN Initiative Cell Census Network (BICCN). This was achieved by coordinated large-scale analyses of single-cell transcriptomes, chromatin accessibility, DNA methylomes, spatially resolved single-cell transcriptomes, morphological and electrophysiological properties, and cellular resolution input-output mapping, integrated through cross-modal computational analysis. Together, our results advance the collective knowledge and understanding of brain cell type organization: First, our study reveals a unified molecular genetic landscape of cortical cell types that congruently integrates their transcriptome, open chromatin and DNA methylation maps. Second, cross-species analysis achieves a unified taxonomy of transcriptomic types and their hierarchical organization that are conserved from mouse to marmoset and human. Third, cross-modal analysis provides compelling evidence for the epigenomic, transcriptomic, and gene regulatory basis of neuronal phenotypes such as their physiological and anatomical properties, demonstrating the biological validity and genomic underpinning of neuron types and subtypes. Fourth, in situ single-cell transcriptomics provides a spatially-resolved cell type atlas of the motor cortex. Fifth, integrated transcriptomic, epigenomic and anatomical analyses reveal the correspondence between neural circuits and transcriptomic cell types. We further present an extensive genetic toolset for targeting and fate mapping glutamatergic projection neuron types toward linking their developmental trajectory to their circuit function. Together, our results establish a unified and mechanistic framework of neuronal cell type organization that integrates multi-layered molecular genetic and spatial information with multi-faceted phenotypic properties.

Summary Seeking new insights into the homeostasis, modulation and plasticity of cortical synaptic networks, we have analyzed results from a single-cell RNA-seq study of 22,439 mouse neocortical neurons. Our analysis exposes transcriptomic evidence for dozens of molecularly distinct neuropeptidergic modulatory networks that directly interconnect all cortical neurons. This evidence begins with a discovery that transcripts of one or more neuropeptide precursor (NPP) and one or more neuropeptide-selective G-protein-coupled receptor (NP-GPCR) genes are highly abundant in all, or very nearly all, cortical neurons. Individual neurons express diverse subsets of NP signaling genes from palettes encoding 18 NPPs and 29 NP-GPCRs. These 47 genes comprise 37 cognate NPP/NP-GPCR pairs, implying the likelihood of local neuropeptide signaling. Here we use neuron-type-specific patterns of NP gene expression to offer specific, testable predictions regarding 37 peptidergic neuromodulatory networks that may play prominent roles in cortical homeostasis and plasticity. Impact Single-cell mRNA sequencing data from mouse neocortex expose evidence for peptidergic neuromodulatory networks that locally interconnect every cortical neuron Data Highlights At least 97% of mouse neocortical neurons express one or more of 18 neuropeptide precursor proteins (NPP) genes at very high levels At least 98% of cortical neurons express one or more of 29 neuropeptide-selective G-protein-coupled receptor (NP-GPCR) genes cognate to the 18 highly expressed NPP genes Neocortical expression of these 18 NPP and 29 NP-GPCR genes is highly neuron-type-specific and their expression patterns differentiate transcriptomic neuron types with exceptional power Neuron-type taxonomy and type-specific expression of 37 cognate NPP / NP-GPCR gene pairs generate testable predictions of at least 37 local intracortical neuromodulation networks

ABSTRACT Abundant anatomical and physiological evidence supports the presence of at least three distinct types of relay glutamatergic neurons in the primate dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) of the thalamus, the brain region that conveys visual information from the retina to the primary visual cortex. Relay neuron diversity has also been described in the mouse dLGN (also known as LGd). Different types of relay neurons in mice, humans and macaques have distinct morphologies, distinct connectivity patterns, and convey different aspects of visual information to the cortex. To investigate the molecular underpinnings of these cell types, and how these relate to other cellular properties and differences in dLGN between human, macaque, and mice, we profiled gene expression in single nuclei and cells using RNA-sequencing. These efforts identified four distinct types of relay neurons in the primate dLGN, magnocellular neurons, parvocellular neurons, and two cell types expressing canonical marker genes for koniocellular neurons. Surprisingly, despite extensive documented morphological and physiological differences between magno- and parvocellular neurons, we identified few genes with significant differential expression between transcriptomic cell types corresponding to these two neuronal populations. We also detected strong donor-specific gene expression signatures in both macaque and human relay neurons. Likewise, the dominant feature of relay neurons of the adult mouse dLGN is high transcriptomic similarity, with an axis of heterogeneity that aligns with core vs. shell portions of mouse dLGN. Together, these data show that transcriptomic differences between principal cell types in the mature mammalian dLGN are subtle relative to striking differences in morphology and cortical projection targets. Finally, we align cellular expression profiles across species and find homologous types of relay neurons in macaque and human, and distinct relay neurons in mouse.

Abstract Consistent identification of neurons in different experimental modalities is a key problem in neuroscience. While methods to perform multimodal measurements in the same set of single neurons have become available, parsing complex relationships across different modalities to uncover neuronal identity is a growing challenge. Here, we present an optimization framework to learn coordinated representations of multimodal data, and apply it to a large multimodal dataset profiling mouse cortical interneurons. Our approach reveals strong alignment between transcriptomic and electrophysiological characterizations, enables accurate cross-modal data prediction, and identifies cell types that are consistent across modalities. Highlights Coupled autoencoders for multimodal assignment, Analysis of Patch-seq data consisting of more than 3000 cells

Abstract Characterizing cellular diversity at different levels of biological organization across data modalities is a prerequisite to understanding the function of cell types in the brain. Classification of neurons is also required to manipulate cell types in controlled ways, and to understand their variation and vulnerability in brain disorders. The BRAIN Initiative Cell Census Network (BICCN) is an integrated network of data generating centers, data archives and data standards developers, with the goal of systematic multimodal brain cell type profiling and characterization. Emphasis of the BICCN is on the whole mouse brain and demonstration of prototypes for human and non-human primate (NHP) brains. Here, we provide a guide to the cellular and spatial approaches employed, and to accessing and using the BICCN data and its extensive resources, including the BRAIN Cell Data Center (BCDC) which serves to manage and integrate data across the ecosystem. We illustrate the power of the BICCN data ecosystem through vignettes highlighting several BICCN analysis and visualization tools. Finally, we present emerging standards that have been developed or adopted by the BICCN toward FAIR (Wilkinson et al. 2016a) neuroscience. The combined BICCN ecosystem provides a comprehensive resource for the exploration and analysis of cell types in the brain.

Abstract Quantification of individual cells’ morphology and their distribution at the whole brain scale is essential to understand the structure and diversity of cell types. Despite recent technological advances, especially single cell labeling and whole brain imaging, for many prevailing animal models, it is exceedingly challenging to reuse similar technologies to study human brains. Here we propose Adaptive Cell Tomography (ACTomography), a low-cost, high-throughput, high-efficacy tomography approach, based on adaptive targeting of individual cells suitable for human-brain scale modeling of single neurons to characterize their 3-D structures, statistical distributions, and extensible for other cellular features. Specifically, we established a platform to inject dyes into cortical neurons in surgical tissues of 18 patients with brain tumors or other conditions and 1 donated fresh postmortem brain. We collected 3-D images of 1746 cortical neurons, of which 852 neurons were subsequentially reconstructed to quantify their local dendritic morphology, and mapped to standard atlases both computationally and semantically. In our data, human neurons are more diverse across brain regions than by subject age or gender. The strong stereotypy within cohorts of brain regions allows generating a statistical tensor-field of neuron morphology to characterize 3-D anatomical modularity of a human brain.

Abstract Large-scale single-cell ‘omics profiling is revolutionising our understanding of cell types in complex organs like the brain, where it is being used to define a complete catalogue of cell types, something that traditional methods struggle with due to the diversity and complexity of the brain. But this poses a problem. How do we organise such a catalogue - providing a standard way to refer to the cell types discovered, linking their classification and properties to supporting data? Cell ontologies provide a solution to recording definitions, classifications, and properties of cell types and provide standard identifiers for annotation, but they currently do not support the data driven cell type definitions and classifications needed for multi-modal single cell ‘omics profiling. Here we describe the construction and application of a semi-automated, data-linked extension to the Cell Ontology that represents cell types in the Primary Motor Cortex of humans, mice and marmosets. The methods and resulting ontology are designed to be scalable and applicable to similar whole brain atlases currently in preparation.